Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки

Работа №7357

Тип работы

Диссертации (РГБ)

Предмет

биология

Объем работы111стр.
Год сдачи2003
Стоимость470 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
748
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК 9
Распространение метилирования ДНК 9
Функция метилирования ДНК 12
Метилирование во время развития 13
Ферменты метилирования 15
Метилирование как динамический процесс 17
Роль метилирования в канцерогенезе 20
Генетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе 22
Эпигенетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе 23
Сравнительный анализ современных методов определения статуса
метилирования ДНК 33
Методы анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов 33
Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в
опухолях 35
Заключение 37
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 38
1. Список использованных реактивов 38
2. Клинические материалы 40
3. Выделение ДНК и РНК из клеточных культур 41
4. Выделение ДНК из лейкоцитов 41
5. Рестрикция геномной ДНК 42
6. Бисульфитная модификация ДНК 43
7. Полимеразная цепная реакция 43
7.1. Праймеры 43
7.2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 45
7.3. Метилчувствительная ПЦР со специфическими
праймерами 46
7.4. Метилспецифическая ПЦР 46
8. Выделение продуктов ПЦР из гелей 47
8.1. Выделение продуктов ПЦР из полиакриламидного геля 47
8.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 47
9. Клонирование продуктов ПЦР 47
9.1. Вектор 47
9.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli 48
9.3. Трансформация клеток Escherichia coli 49
9.4. Выделение плазмидной ДНК 49
10. Гель-электрофорез 50
10.1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле 50
10.2. Электрофоретическое разделение РНК в агарозном геле 51
10.3. Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле 52
11. Блот-гибридизация 53
11.1. Перенос ДНК на нейлоновую мембрану 53
11.2. Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану 53
11.3. Получение меченого зонда 54
11.4. Гибридизация ДНК (РНК), иммобилизованной на мембране 54
12. Обратная транскрипция 55
13. Переосаждение ДНК (РНК) 55
14. Анализ нуклеотидных последовательностей 55
14.1. Поиск гомологий в банках данных 55
14.2. Критерии CpG-островков 56
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 57
1. Поиск CpG-островков, гиперметилированных в опухолях шейки матки 57
1.1. Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 57
1.2. Анализ фрагментов, выявленных с помощью метилчувствительной
ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 63
1.3. Определение статуса метилирования CpG-островка 32 при раке
шейки матки 70
1.4. Определение полного размера CpG-островка гена вЗА-адаптина 72
2. Исследование экспрессии и статуса метилирования гена вЗА-адаптина
при раке шейки матки 76
2.1. Исследование экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки 76
2.2. Изучение статуса метилирования CpG-островка гена вЗА-адаптина в
опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки 78
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 86
ВЫВОДЫ 94
ЛИТЕРАТУРА 95



Актуальность темы: Рак шейки матки занимает второе место среди всех онкологических заболеваний у женщин. Этиологическим фактором рака шейки матки (РШМ) признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы высокого риска (типы 16, 18 и другие). После вирусной инфекции РШМ может развиться через стадии дисплазии, рака in situ на протяжении нескольких лет, в течение которых в прогрессию опухоли вносят вклад возникающие и накапливающиеся изменения в клеточных генах, регулирующих такие важные для нормальной жизнедеятельности клетки процессы, как пролиферация, апоптоз, ангиогенез, поддержание генетической стабильности.
В последнее десятилетие было установлено, что в многостадийном процессе образования опухолей нарушение функций клеточных генов может происходить не только в результате генетических событий (точечные мутации, делеции, амплификация и реарранжировка генов), но и в результате эпигенетических изменений, в том числе локального гиперметилирования ДНК. Аберрантному метилированию в опухолевых клетках подвергаются специфические последовательности - CpG-островки, ассоциированные с 5’ регуляторными районами многих генов. В нормальных клетках большинство CpG-островков не метилировано, а их метилирование в опухолевых клетках, как правило, сопровождается подавлением транскрипции соответствующего гена, наследуемой при делении клетки. Механизмы инициации локального метилирования CpG-островков в опухолях пока не ясны.
В последнее время разработаны методы идентификации гиперметилированных районов ДНК, основанные на дифференциальном статусе метилирования CpG-островков в нормальных и опухолевых клетках. Во многих случаях с помощью этих методов были идентифицированы гены, инактивируемые в опухолях путем аберрантного метилирования ассоциированных с ними CpG-островков. Среди них обнаружены как новые гены, утрата функций которых оказалась существенной для развития

- 7 -
опухолей, так и известные гены, подавление экспрессии которых в опухолях в отсутствии инактивирующих мутаций уже было продемонстрировано. Число генов, для которых обнаружен альтернативный мутациям эпигенетический механизм инактивации в опухолях, постоянно растет, что свидетельствует о широком распространении этого механизма в процессе канцерогенеза.
Цель настоящей работы: Идентификация гиперметилированных в опухолях шейки матки CpG-островков и ассоциированных с ними генов, экспрессия которых может быть подавлена вследствие нарушения метилирования ДНК.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1) Провести скрининг аберрантно-метилированных GC-богатых последовательностей ДНК в карциномах шейки матки методом метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, определить нуклеотидную последовательность обнаруженных GC- богатых фрагментов ДНК, выявить среди них CpG-островки.
2) Провести поиск в базах данных гомологий выявленных CpG-островков с известными последовательностями ДНК.
3) В случае отсутствия гомологий CpG-островка с известными последовательностями в базах данных, провести клонирование и определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, фланкирующих CpG-островок для его локализации в геноме человека.
4) В случае установления ассоциации выявленных CpG-островков с генами, провести анализ статуса метилирования и экспрессии соответствующих генов в первичных опухолях и клеточных линиях карцином шейки матки.
Научная новизна и практическая ценность работы:
С помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC- богатыми праймерами было выявлено 7 GC-богатых фрагментов ДНК длиной от 300 до 1200 пар оснований, пять из которых (более двух третей)

- 8 -
обладают свойствами CpG-островков. Из пяти выявленных CpG-островков два оказались непредставленными в опубликованных версиях генома человека: фрагмент 26 был представлен неполностью (отсутствовала область, фланкирующая 5' конец гена в3А-адаптина), фрагмент 22 до сих пор отсутствует в опубликованных базах данных.
В работе впервые показано подавление экспрессии мРНК гена @3А- адаптина в клеточных линиях рака шейки матки. Продукт гена @3А- адаптина представляет собой одну из субъединиц адаптерного комплекса АР-3, вовлеченного во внутриклеточный транспорт белков. Показана возможность восстановления экспрессии мРНК в3А-адаптина под действием деметилирующего агента 5-азацитидина, что указывает на связь процессов метилирования и транскрипции гена. Впервые определена нуклеотидная последовательность района, прилегающего к 5’ концу гена. Установлены размер первого экзона гена @3А-адаптина и размер CpG-островка, ассоциированного с геном. CpG-островок гена @3А-адаптина включает 5’ нетранскрибируемый район гена, первый экзон и начало первого интрона.
Теоретическое значение работы заключается в получении новых данных об участии клеточных генов в механизме злокачественной трансформации под действием вирусов папиллом человека. Обнаруженное подавление экспрессии гена @3А-адаптина в клетках карцином шейки матки указывает на необходимость дальнейшего исследования роли белковых комплексов, вовлеченных в эндо/экзоцитоз белков, в канцерогенезе. Показана возможность идентифицикации CpG-островков, до сих пор не представленных в опубликованных версиях нуклеотидных последовательностей генома человека, с помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, что позволяет получить информацию о GC-богатых трудноклонируемых районах генома человека.


Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

1. С помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC- богатыми праймерами было выявлено семь GC-богатых фрагментов ДНК, пять из которых (более двух третей) обладают свойствами CpG-островков. Из пяти выявленных CpG-островков два оказались непредставленными в опубликованных версиях генома человека.
2. С помощью компьютерного анализа установлено, что для CpG-островка 22 (GenBank AF218212) гомологичная последовательность в базах данных не представлена. CpG-островки 32 и 34 локализованы соответственно на 13 и Х хромосомах, ассоциация с известными генами отсутствует. CpG- островок 36 имеет гомологию с 3.3-kb тандемным повтором, располагающимся в прителомерной области длинного плеча хромосом 4 и 10, и с кДНК гена DUX4, кодируемой одной копией этого повтора. CpG- островок 26 (GenBank AF247736) имеет частичную гомологию с кДНК гена вЗА-адаптина.
3. Экспериментально определена нуклеотидная последовательность 5' регуляторной зоны и граница 1 экзона гена вЗА-адаптина (GenBank AF247736.2), и установлен размер (868 п.н.) и местоположение CpG- островка гена вЗА-адаптина. CpG-островок гена включает 5' нетранскрибируемую область, первый экзон и 5' конец первого интрона.
4. Методами гибридизации и ПЦР в сочетании с метилчувствительной рестрикцией и секвенирования обработанной бисульфитом натрия ДНК установлено, что CpG-островок гена вЗА-адаптина не подвергается метилированию в плоскоклеточных карциномах шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки.
5. Впервые показано, что экспрессия гена вЗА-адаптина снижена в клеточных линиях рака шейки матки и может быть активирована обработкой деметилирующим агентом 5-азацитидином, несмотря на отсутствие метилирования CpG-островка гена.



1. Ahluwalia A, Hurteau JA, Bigsby RM and Nephew KP. DNA methylation in ovarian cancer. II. Expression of DNA methyltransferases in ovarian cancer cell lines and normal ovarian epithelial cells.// Gynecol. Oncol., 2001, 82, pp. 299¬304.
2. Ammanamanchi S, Kim SJ, Sun LZ and Brattain MG. Induction of transforming growth factor-beta receptor type II expression in estrogen receptor-positive breast cancer cells through SP1 activation by 5-aza-2'- deoxycytidine.// J. Biol. Chem., 1998, 273, pp. 16527-16534.
3. Antequera F and Bird AP. Number of CpG islands and genes in human and mouse.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, pp. 11995-11999.
4. Antequera F, Boyes J and Bird A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines.// Cell, 1990, 62, pp. 503-514.
5. Bakin AV and Curran T. Role of DNA 5-methylcytosine transferase in cell transformation by fos.// Science, 1999, 283, pp. 387-390.
6. Barlow DP. Methylation and imprinting: from host defense to gene regulation?// Science, 1993, 260, pp. 309-310.
7. Baylin SB and Herman JG. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics.// Trends Genet., 2000, 16, pp. 168-174.
8. Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM and Issa JP. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia.// Adv. Cancer Res., 1998, 72, 141-196.
9. Baylin SB, Hoppener JW, de Bustros A, Steenbergh PH, Lips CJ and Nelkin BD. DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung cancers and lymphomas.// Cancer Res., 1986, 46, pp. 2917-2922.
10. Belinsky SA, Nikula KJ, Palmisano WA, Michels R, Saccomanno G, Gabrielson E, Baylin SB and Herman JG. Aberrant methylation of p16INK4a is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, pp. 11891-11896.

- 96 -
11. Bestor TH and Tycko B. Creation of genomic methylation patterns.// Nat. Genet., 1996, 12, pp. 363-367.
12. Bestor TH. Activation of mammalian DNA methyltransferase by cleavage of a Zn binding regulatory domain.// EMBO J., 1992, 11, pp. 2611-2517.
13. Bird AP, Taggart MH, Nicholls RD and Higgs DR. Non-methylated CpG-rich islands at the human a-globin locus: Implications for evolution of the a-globin pseudogene.// EMBO J., 1987, 6, pp. 999-1004.
14. Bird AP. CpG-rich islands and the function of DNA methylation.// Nature, 1986, 321, pp. 209-213.
15. Bird AP. DNA methylation patterns and epigenetic memory.// Genes & Dev., 2002, 16, pp. 6-21.
16. Bird AP. Gene number, noise reduction and biological complexity.// Trends Genet., 1995, 11, pp. 94-100.
17. Boehm M and Bonifacino JS. Adaptins - the final recount.// Mol. Biol. Cell, 2001, 12, pp. 2907-2920.
18. Boehm M and Bonifacino JS. Genetic analyses of adaptin function from yeast to mammals.// Gene, 2002, 286, pp. 175-186.
19. Boggs BA, Cheung P, Heard E, Spector DL, Chinault AC and Allis CD. Differentially methylated forms of histone H3 show unique association patterns with inactive human X chromosomes.// Nat. Genet., 2002, 30, pp. 73-76.
20. Cappabianca L, Farina AR, Tacconelli A, Mantovani R, Gulino A and Mackay AR. Reconstitution of TIMP-2 expression in SH-SY5Y neuroblastoma cells by 5-azacytidine is mediated transcriptionally by NF-Y through an inverted CCAAT site.// Exp. Cell Res., 2003, 286, pp. 209-218.
21. Carotti D, Funiciello S, Palitti F and Strom R. Influence of pre-existing methylation on the de novo activity of eukaryotic DNA methyltransferase.// Biochemistry, 1998, 37, pp. 1101-1108.
22. Chen RZ, Pettersson U, Beard C, Jackson-Grusby L and Jaenisch R. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates.// Nature, 1998, 395, pp. 89¬
93.

- 97 -
23. Chuang LS, Ian HI, Koh TW, Ng HH, Xu G and Li BF. Human DNA- (cytosine-5) methyltransferase-PCNA complex as a target for p21WAF1.// Science, 1997, 277, pp. 1996-2000.
24. Clark SJ, Harrison J, Paul CL and Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines.// Nucl. Acids Res., 1994, 22, pp. 2290-2297.
25. Costello JF, Fruhwald MC, Smiraglia DJ, Rush LJ, Robertson GP, Gao X, Wright FA, Feramisco JD, Peltomaki P, Lang JC, Schuller DE, Yu L, Bloomfield CD, Caligiuri MA, Yates A, Nishikawa R, Huang HJS, Petrelli NJ, Zhang X, O’Dorisio MS, Held WA, Cavenee WK and Plass C. Aberrant CpG- island methylation has non-random and tumour-type-specific patterns.// Nat Genet., 2000, 25, 132-138.
26. Cote S, Sinnett D and Momparler RL. Demethylation by 5-aza-2'-deoxycytidine of specific 5-methylcytosine sites in the promoter region of the retinoic acid receptor beta gene in human colon carcinoma cells.// Anticancer Drugs, 1998,
9, pp. 743-759.
27. Cross SH, Charlton JA, Nan X and Bird AP. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column.// Nat. Genet., 1994, 6(3), pp. 236-244.
28. Dell’Angelica EC, Ooi CE and Bonifacino JS. p3A-adaptin, a subunit of the adaptor-like complex AP-3.// J. Biol. Chem., 1997, 272(24), pp. 15078-15084.
29. Di Croce L, Raker VA, Corsaro M, Fazi F, Fanelli M, Faretta M, Fuks F, Lo Coco F, Kouzarides T, Nervi C, Minucci S and Pelicci PG. Methyltransferase recruitment and DNA hypermethylation of target promoters by an oncogenic transcription factor.// Science, 2002, 295, pp. 1079-1082.
30. Eng C, Herman JG and Baylin SB. A bird's eye view of global methylation.// Nat. Genet., 2000, 24, pp. 101-102.
31. Esteller M, Catasus L, Matias-Guiu X, Mutter GL, Prat J, Baylin SB and Herman JG. hMLH1 promoter hypermethylation is an early event in human endometrial tumorigenesis.// Am. J. Pathol., 1999, 155, pp. 1767-1772.

- 98 -
32. Esteller M, Corn PG, Urena JM, Gabrielson E, Baylin SB and Herman JG. Inactivation of glutathione S-transferase P1 gene by promoter hypermethylation in human neoplasia.// Cancer Res., 1998, 58, pp. 4515-4518.
33. Esteller M, Hamilton SR, Burger PC, Baylin SB and Herman JG. Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia.// Cancer Res., 1999, 59, pp. 793-797.
34. Esteller M, Risques RA, Toyota M, Capella G, Moreno V, Peinado MA, Baylin SB and Herman JG. Promoter hypermethylation of the DNA repair gene O6- methylguanine-DNA methyltransferase is associated with the presence of G:C to A:T transition mutations in p53 in human colorectal tumorigenesis.// Cancer Res., 2001, 61, pp. 4689-4692.
35. Esteller M, Toyota M, Sanchez-Cespedes M, Capella G, Peinado MA, Watkins DN, Issa JP, Sidransky D, Baylin SB and Herman JG. Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is associated with G to A mutations in K-ras in colorectal tumorigenesis.// Cancer Res., 2000, 60, pp. 2368-2371.
36. Finnegan EJ, Peacock WJ and Dennis ES. DNA methylation, a key regulator of plant development and other processes.// Curr. Opin. Genet. Dev., 2000, 10, pp. 217-223.
37. Floyd S and De Camilli P. Endocytosis proteins and cancer: a potential link?// Trends Cell Biol., 1998, 8, pp. 299-301.
38. Gabriels J, Beckers MC, Ding H, De Vriese A, Plaisance S, van der Maarel SM, Padberg GW, Frants RR, Hewitt JE, Collen D and Belayew A. Nucleotide sequence of the partially deleted D4Z4 locus in a patient with FSHD identifies a putative gene within each 3.3 kb element.// Gene, 1999, 236, 25-32.
39. Gacy AM, Goellner G, Juranic N, Macura S and McMurray CT. Trinucleotide repeats that expand in human disease form hairpin structures in vitro.// Cell, 1995, 81, pp. 533-540.

- 99 -
40. Gardiner-Gardner M and Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes.// J. Mol. Biol., 1987, 196, pp. 261-282.
41. van Geel M, Dickson MC, Beck AF, Bolland DJ, Frants RR, van der Maarel SM, de Jong PJ and Hewitt JE. Genomic analysis of human chromosome 10q and 4q telomeres suggests a common origin.// Genomics, 2002, 79, pp. 210¬217.
42. Gonzalgo ML, Liang G, Spruck CH, Zingg JM, Rideout WM and Jones PA. Identification and characterization of differentially methylated regions of genomic DNA by methylation-sensitive arbitrarily primed PCR.// Cancer Res.,
1997, 57, pp. 594-599.
43. Gowher H, Leismann O and Jeltsch A. DNA of Drosophila melanogaster contains 5-methylcytosine.// EMBO J, 2000, 19, pp. 6918-6923.
44. Graff JR, Herman JG, Lapidus RG, Chopra H, Xu R, Jarrard DF, Isaacs WB, Pitha PM, Davidson NE and Baylin SB. E-cadherin expression is silenced by DNA hypermethylation in human breast and prostate carcinomas.// Cancer Res., 1995, 55, pp. 5195-5199.
45. Cui H, Horon IL, Ohlsson R, Hamilton SR and Feinberg AP. Loss of imprinting in normal tissue of colorectal cancer patients with microsatellite instability.// Nat. Med., 1998, 4, pp. 1276-1280.
46. Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD and Baylin SB. Methylation- specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, pp.9821-9826.
47. Herman JG, Latif F, Weng Y, Lerman MI, Zbar B, Liu S, Samid D, Duan DS, Gnarra JR, Linehan WM and Baylin SB. Silencing of the VHL tumor- suppressor gene by DNA methylation in renal carcinoma.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, pp. 9700-9704.
48. Herman JG, Umar A, Polyak K, Graff JR, Ahuja N, Issa JP, Markowitz S, Willson JK, Hamilton SR, Kinzler KW, Kane MF, Kolodner RD, Vogelstein B, Kunkel TA and Baylin SB. Incidence and functional consequences of hMLH1

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.



Подобные работы


©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.