Изучение взаимодействия каналов TRPC с бел ками ORAI в клетках линии НЕК293
|
Список используемых сокращений: 4
Введение. 7
Цель и задачи работы 8
Обзор литературы 9
Депо-управляемый вход кальция 9
Молекулярная структура кальциевых сенсоров STIM 10
Перемещение кальциевых сенсоров STIM к плазматической мембране в область пункт 11
Морфология и молекулярный состав пункт 13
Функции кальциевых сенсоров STIM1, STIM2 и их изоформ 15
Депо-управляемые каналы ORAI 18
Взаимодействие белков ORAI и STIM 19
Молекулярная структура каналов TRPC 23
Физиологическая роль каналов TRPC 24
Взаимодействие белков TRPC, ORAI и STIM 25
Депо-управляемые каналы в клетках линии HEK293 29
Каналы Imin 31
Каналы Ins 32
Каналы Imax 32
Постановка задачи 33
Методы и материалы 33
1. Работа с клеточными культурами 33
1.1 Ведение клеточной линии HEK293 (клетки почки эмбриона человека) 33
1.2 Липосомальная трансфекция клеток линии HEK293 34
1.3 Подавление экспрессии белков (РНК-интерференция): 35
1.4 Получение клеточных лизатов 35
2. Белковый электрофорез в ПААГ и иммуноанализ экспрессии белков 35
3. Метод локальной фиксации потенциала 36
4. Используемое программное обеспечение 38
Результаты и обсуждение. 39
Сверхэкспрессия доминантно-негативных мутантов ORAI не ингибирует активность каналов Imax 39
Селективность каналов Imax не зависит от уровня экспрессии белка STIM 41
Развитие активности каналов Imax, индуцированное белком STIM2 происходит медленнее, чем активация каналов белком STIM1 44
Зависимость активности каналов Imax от потенциала на плазматической мембране различается в растворах кальция и бария 45
Обсуждение 47
Выводы 50
Список используемой литературы 51
Введение. 7
Цель и задачи работы 8
Обзор литературы 9
Депо-управляемый вход кальция 9
Молекулярная структура кальциевых сенсоров STIM 10
Перемещение кальциевых сенсоров STIM к плазматической мембране в область пункт 11
Морфология и молекулярный состав пункт 13
Функции кальциевых сенсоров STIM1, STIM2 и их изоформ 15
Депо-управляемые каналы ORAI 18
Взаимодействие белков ORAI и STIM 19
Молекулярная структура каналов TRPC 23
Физиологическая роль каналов TRPC 24
Взаимодействие белков TRPC, ORAI и STIM 25
Депо-управляемые каналы в клетках линии HEK293 29
Каналы Imin 31
Каналы Ins 32
Каналы Imax 32
Постановка задачи 33
Методы и материалы 33
1. Работа с клеточными культурами 33
1.1 Ведение клеточной линии HEK293 (клетки почки эмбриона человека) 33
1.2 Липосомальная трансфекция клеток линии HEK293 34
1.3 Подавление экспрессии белков (РНК-интерференция): 35
1.4 Получение клеточных лизатов 35
2. Белковый электрофорез в ПААГ и иммуноанализ экспрессии белков 35
3. Метод локальной фиксации потенциала 36
4. Используемое программное обеспечение 38
Результаты и обсуждение. 39
Сверхэкспрессия доминантно-негативных мутантов ORAI не ингибирует активность каналов Imax 39
Селективность каналов Imax не зависит от уровня экспрессии белка STIM 41
Развитие активности каналов Imax, индуцированное белком STIM2 происходит медленнее, чем активация каналов белком STIM1 44
Зависимость активности каналов Imax от потенциала на плазматической мембране различается в растворах кальция и бария 45
Обсуждение 47
Выводы 50
Список используемой литературы 51
Кальций участвует в проведении внутриклеточных сигналов во всех живых организмах. Кальциевым сигналом называют локальное повышение концентрации кальция в цитоплазме, которое приводит к активации или ингибированию различных внутриклеточных белков.
Через систему кальциевой сигнализации осуществляется регуляция множества внутриклеточных процессов, таких как пролиферация и дифференцировка клетки, запуск сигнальных каскадов, проведение нервного импульса и других функций, необходимых для нормальной работы живой клетки.
Концентрации свободного кальция внутри клетки очень мала — приблизительно 100 нМ. Во внеклеточной среде кальций содержится в милимолярных концентрациях. Постоянство внутриклеточной концентрации кальция поддерживает множество механизмов. Во-первых, внутриклеточный кальций постоянно выводится из цитоплазмы АТФазами и обменниками либо во внеклеточное пространство, либо во внутриклеточные кальциевые депо — эндоплазматический ретикулум (ЭР) и митохондрии. Во-вторых, в цитоплазме кальций может быть связан кальций-связывающими белками. И напротив существует два способа поступления кальция в цитоплазму: из внеклеточного пространства, откуда кальций переносится за счет работы потенциал-управляемых каналов и из кальциевых депо, а именно из эндоплазматического ретикулума. В электроневозбудимых клетках эти пути тесно связаны.
Когда кальций по градиенту концентрации вышел из депо, начинают работать кальциевые сенсоры STIM, расположенные на мембране ЭР. Они активируют депо- управляемые каналы, которые находятся на плазматической мембране клетки. Через них кальций поступает в цитоплазму, откуда закачивается в депо.
Нарушения в системе поддержания кальциевого гомеостаза приводят к возникновению болезней различной природы: нейродегенеративных, онкологических, аутоиммунных заболеваний, миопатий и других серьезных патологий ([Feske, 2011], [Oh- hora, Rao, 2008]; [Zui, JianJie, 2016]; [Ryazantseva и др, 2013]).
Известно, что пору депо-управляемых каналов могут образовывать белки семейств ORAI и TRPC. Каналы ORAI высокоселективны по отношению к двухвалентным ионам и характеризуются чрезвычайно низкой проводимостью. Считается, что именно эти каналы играют ключевую роль в поддержании депо-управляемого входа кальция в клетку. Нокаут по белкам ORAI практически полностью элиминирует депо-управляемый вход [Lee и др., 2011].
Каналы TRPC менее селективны по отношению к двухвалентным ионам и их проводимость выше на два-три порядка [Cheng и др., 2013]. Кроме того, есть данные об активации каналов TRPC производными каскада фосфолипазы С (PLC) (возможно диацилглицеролом (DAG)) независимо от опустошения депо [Cheng и др., 2013]; [Asanov и др., 2015].
Показано, что активность каналов ORAI и TRPC взаимосвязана [Shin и др., 2016].
В литературе описаны противоречивые данные о взаимодействии каналов ORAI и TRPC:
1) Каналы TRPC работают независимо от каналов ORAI [Dehaven и др., 2009],
2) Каналы TRPC и ORAI формируют гетеромеры [Liao и др., 2008],
3) Активация каналов TRPC происходит вслед за входом кальция через каналы ORAI ([Cheng и др., 2011]; [Ong, Ambudkar, 2015]),
4) Кальциевый сенсор STIM напрямую активирует каналы TRPC ([Weizhong Zeng,ii др 2009]; [Asanov и др., 2015]).
Поскольку данные противоречивы, то целью работы было изучить входит ли белок ORAI1 в состав проводящей поры эндогенных каналов TRPC1 и участвует ли он в регуляции этих каналов.
В качестве модельного объекта для изучения депо-управляемых каналов TRPC 1 мы использовали эндогенные канал Imax клеток линии НЕК293. Показано, что канал Imax активируется в ответ на опустошение кальциевого депо и что в состав поры канала входят белки TRPC1 [Skopin и др., 2013]. Известно, что в клетках линии HEK293 работают и канал Imax и эндогенные каналы ORAI1 [Shalygin и др., 2015].
Цель и задачи работы.
Изучить входит ли белок ORAI в состав проводящей поры каналов TRPC1 и участвует ли он в регуляции этих каналов в клетках линии НЕК293.
Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:
1. Охарактеризовать изменение активности кальциевых каналов Imax (включающих в свой состав белки TRPC1) при сверхэкспрессии доминантно-негативного мутанта белка ORAI1 E106Q.
2. Выяснить, как зависит селективность каналов Imax от уровня экспрессии основных активаторов депо-управляемых каналов ORAI, белков STIM1 и STIM2.
3. Сравнить активацию каналов Imax, вызванную белками STIM1 и STIM2.
4. Сравнить активность каналов Imax в случае, когда носителем тока являются ионы кальция и ионы бария.
Через систему кальциевой сигнализации осуществляется регуляция множества внутриклеточных процессов, таких как пролиферация и дифференцировка клетки, запуск сигнальных каскадов, проведение нервного импульса и других функций, необходимых для нормальной работы живой клетки.
Концентрации свободного кальция внутри клетки очень мала — приблизительно 100 нМ. Во внеклеточной среде кальций содержится в милимолярных концентрациях. Постоянство внутриклеточной концентрации кальция поддерживает множество механизмов. Во-первых, внутриклеточный кальций постоянно выводится из цитоплазмы АТФазами и обменниками либо во внеклеточное пространство, либо во внутриклеточные кальциевые депо — эндоплазматический ретикулум (ЭР) и митохондрии. Во-вторых, в цитоплазме кальций может быть связан кальций-связывающими белками. И напротив существует два способа поступления кальция в цитоплазму: из внеклеточного пространства, откуда кальций переносится за счет работы потенциал-управляемых каналов и из кальциевых депо, а именно из эндоплазматического ретикулума. В электроневозбудимых клетках эти пути тесно связаны.
Когда кальций по градиенту концентрации вышел из депо, начинают работать кальциевые сенсоры STIM, расположенные на мембране ЭР. Они активируют депо- управляемые каналы, которые находятся на плазматической мембране клетки. Через них кальций поступает в цитоплазму, откуда закачивается в депо.
Нарушения в системе поддержания кальциевого гомеостаза приводят к возникновению болезней различной природы: нейродегенеративных, онкологических, аутоиммунных заболеваний, миопатий и других серьезных патологий ([Feske, 2011], [Oh- hora, Rao, 2008]; [Zui, JianJie, 2016]; [Ryazantseva и др, 2013]).
Известно, что пору депо-управляемых каналов могут образовывать белки семейств ORAI и TRPC. Каналы ORAI высокоселективны по отношению к двухвалентным ионам и характеризуются чрезвычайно низкой проводимостью. Считается, что именно эти каналы играют ключевую роль в поддержании депо-управляемого входа кальция в клетку. Нокаут по белкам ORAI практически полностью элиминирует депо-управляемый вход [Lee и др., 2011].
Каналы TRPC менее селективны по отношению к двухвалентным ионам и их проводимость выше на два-три порядка [Cheng и др., 2013]. Кроме того, есть данные об активации каналов TRPC производными каскада фосфолипазы С (PLC) (возможно диацилглицеролом (DAG)) независимо от опустошения депо [Cheng и др., 2013]; [Asanov и др., 2015].
Показано, что активность каналов ORAI и TRPC взаимосвязана [Shin и др., 2016].
В литературе описаны противоречивые данные о взаимодействии каналов ORAI и TRPC:
1) Каналы TRPC работают независимо от каналов ORAI [Dehaven и др., 2009],
2) Каналы TRPC и ORAI формируют гетеромеры [Liao и др., 2008],
3) Активация каналов TRPC происходит вслед за входом кальция через каналы ORAI ([Cheng и др., 2011]; [Ong, Ambudkar, 2015]),
4) Кальциевый сенсор STIM напрямую активирует каналы TRPC ([Weizhong Zeng,ii др 2009]; [Asanov и др., 2015]).
Поскольку данные противоречивы, то целью работы было изучить входит ли белок ORAI1 в состав проводящей поры эндогенных каналов TRPC1 и участвует ли он в регуляции этих каналов.
В качестве модельного объекта для изучения депо-управляемых каналов TRPC 1 мы использовали эндогенные канал Imax клеток линии НЕК293. Показано, что канал Imax активируется в ответ на опустошение кальциевого депо и что в состав поры канала входят белки TRPC1 [Skopin и др., 2013]. Известно, что в клетках линии HEK293 работают и канал Imax и эндогенные каналы ORAI1 [Shalygin и др., 2015].
Цель и задачи работы.
Изучить входит ли белок ORAI в состав проводящей поры каналов TRPC1 и участвует ли он в регуляции этих каналов в клетках линии НЕК293.
Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:
1. Охарактеризовать изменение активности кальциевых каналов Imax (включающих в свой состав белки TRPC1) при сверхэкспрессии доминантно-негативного мутанта белка ORAI1 E106Q.
2. Выяснить, как зависит селективность каналов Imax от уровня экспрессии основных активаторов депо-управляемых каналов ORAI, белков STIM1 и STIM2.
3. Сравнить активацию каналов Imax, вызванную белками STIM1 и STIM2.
4. Сравнить активность каналов Imax в случае, когда носителем тока являются ионы кальция и ионы бария.
1) В клетках линии HEK293 с сверхэкспрессией мутантного белка ORAI1 E106Q депо-управляемые каналы Imax, включающие в свой состав белки TRPC1, не активируются при опустошении депо тапсигаргином, однако проводящая пора каналов Imax не менялась, поскольку каналы можно было активировать агонистом.
2) Селективность каналов Imax не зависит от уровня экспрессии белка STIM, в отличие от каналов ORAI.
3) Развитие активности каналов Imax, индуцированное белком STIM2 происходит медленнее, чем активация каналов белком STIM1, что сходно с регуляцией каналов ORAI белками STIM.
4) Зависимость вероятности открытого состояния каналов Imax от потенциала противоположна для растворов, где носителем является барий или кальций, что аналогично характеристикам каналов ORAI в идентичных условиях.
5) Таким образом, белок ORAI не входит в пору эндогенного канала Imax. Можно предположить, что активация каналов ORAI необходима для чувствительности каналов Imax к опустошению депо.
2) Селективность каналов Imax не зависит от уровня экспрессии белка STIM, в отличие от каналов ORAI.
3) Развитие активности каналов Imax, индуцированное белком STIM2 происходит медленнее, чем активация каналов белком STIM1, что сходно с регуляцией каналов ORAI белками STIM.
4) Зависимость вероятности открытого состояния каналов Imax от потенциала противоположна для растворов, где носителем является барий или кальций, что аналогично характеристикам каналов ORAI в идентичных условиях.
5) Таким образом, белок ORAI не входит в пору эндогенного канала Imax. Можно предположить, что активация каналов ORAI необходима для чувствительности каналов Imax к опустошению депо.