Метанолдегидрогеназа из бесклеточного экстракта метилобактерий M.extorquens pCM160 как биокатализатор амперометрического медиаторного биосенсора
|
Введение 4
1. Литературный обзор 6
1.1. Аэробные метилотрофные бактерии 6
1.1.1. Род Methylobacterium 6
1.1.2. Характеристика PQQ - зависимой дегидрогеназы метилобактерий .... 8
1.1.3. Рекомбинантный штамм Methylobacterium extorquens pCM160 10
1.2. Ферментативная кинетика МДГ 11
1.3. Медиаторы в амперометрических биосенсорах 15
1.4. Биосенсоры на основе клеток метилотрофных бактерий 18
2. Экспериментальная часть 24
2.1. Использованные материалы 24
2.2. Культивирование метилотрофных бактерий 24
2.3. Получение бесклеточного экстракта 25
2.4. Спектрофотометрические измерения 25
2.4.1. Определение активности фермента 25
2.4.2. Количественное определение белка по методу Лоури 26
2.5. Электрохимические измерения 27
2.5.1. Медиаторный биосенсор 27
2.5.2. Формирование рабочего электрода 28
2.5.3. Электрохимические измерения окислительной активности
бесклеточного экстракта метилобактерий 29
3. Результаты и обсуждение 31
3.1. Культивирование биомассы рекомбинантных метилобактерий M. extorquens
pCM160 31
3.2. Количественное определение содержания белка в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 31
3.3. Определение активности МДГ спектрофотометрическим методом 33
3.4. Определение субстратной специфичности бесклеточного экстракта
M.extorquens pCM160 спектрофотометрическим методом 35
3.5. Определение кинетических параметров фермента МДГ в бесклеточном
экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам спектрофотометрическим методом 36
3.6. Бесклеточный экстракт Methylobacterium extorquens pCM160 как основа
функционирования амперометрического медиаторного биосенсора 40
3.6.1. Селективность медиаторных сенсоров на основе бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерийM.extorquens pCM160 42
3.6.2. Определение кинетических параметров фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам амперометрическим методом 43
3.7. Сравнительный анализ результатов, полученных спектрофотометрическим
и электрохимическим методами 50
Выводы 54
Список литературы 56
Приложение
1. Литературный обзор 6
1.1. Аэробные метилотрофные бактерии 6
1.1.1. Род Methylobacterium 6
1.1.2. Характеристика PQQ - зависимой дегидрогеназы метилобактерий .... 8
1.1.3. Рекомбинантный штамм Methylobacterium extorquens pCM160 10
1.2. Ферментативная кинетика МДГ 11
1.3. Медиаторы в амперометрических биосенсорах 15
1.4. Биосенсоры на основе клеток метилотрофных бактерий 18
2. Экспериментальная часть 24
2.1. Использованные материалы 24
2.2. Культивирование метилотрофных бактерий 24
2.3. Получение бесклеточного экстракта 25
2.4. Спектрофотометрические измерения 25
2.4.1. Определение активности фермента 25
2.4.2. Количественное определение белка по методу Лоури 26
2.5. Электрохимические измерения 27
2.5.1. Медиаторный биосенсор 27
2.5.2. Формирование рабочего электрода 28
2.5.3. Электрохимические измерения окислительной активности
бесклеточного экстракта метилобактерий 29
3. Результаты и обсуждение 31
3.1. Культивирование биомассы рекомбинантных метилобактерий M. extorquens
pCM160 31
3.2. Количественное определение содержания белка в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 31
3.3. Определение активности МДГ спектрофотометрическим методом 33
3.4. Определение субстратной специфичности бесклеточного экстракта
M.extorquens pCM160 спектрофотометрическим методом 35
3.5. Определение кинетических параметров фермента МДГ в бесклеточном
экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам спектрофотометрическим методом 36
3.6. Бесклеточный экстракт Methylobacterium extorquens pCM160 как основа
функционирования амперометрического медиаторного биосенсора 40
3.6.1. Селективность медиаторных сенсоров на основе бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерийM.extorquens pCM160 42
3.6.2. Определение кинетических параметров фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам амперометрическим методом 43
3.7. Сравнительный анализ результатов, полученных спектрофотометрическим
и электрохимическим методами 50
Выводы 54
Список литературы 56
Приложение
В настоящее время одно из ключевых мест в промышленности занимает углеродное сырье, наиболее распространенным из которых является метанол. Он является достаточно доступным и сравнительно недорогим непищевым сырьем, который используется в качестве источника углерода для своеобразных организмов - метилобактерий, применяемых при проведении различных биотехнологических процессов.
Род Methylobacteriumявляется одним из наиболее изученных [1] и играет большую роль в научных исследованиях, в частности, для мониторинга уровня токсичных соединений С1 и их последующей биоремедиации [2].
Одной из особенностей метилобактерий является высокая концентрация в периплазматической мембране пирролохинолинхинон (PQQ) - зависимых дегидрогеназ. Основной из них является метанолдегидрогеназа (МДГ) - фермент, катализирующий окисление метанола до формальдегида, а также способный окислять первичные спирты и альдегиды, используя искусственные акцепторы электронов.
Клетки метилобактерий, их бесклеточный экстракт, фермент МДГ могут являться основой при создании биосенсорных систем мониторинга С1 соединений в природных и антропогенно загрязненных экосистемах.
Работа с биосенсорами на основе микроорганизмов часто сопровождается внедрением биокатализаторов (ферментов, ускоряющих реакцию) в процесс анализа [3]. Ими могут быть, например, клетки метилотрофных бактерий, бесклеточный экстракт метилобактерий или фермент МДГ, входящий в их состав . Количество научной литературы, описывающей амперометрические биосенсоры на основе метилобактерий, фермента МДГ и медиаторов электронного транспорта невелико, поэтому применение бесклеточного экстракта метилобактерий в качестве биокатализаторов и разработка на его основе амперометрического медиаторного биосенсора является актуальной задачей.
Целью настоящей работы является изучение биокаталитических свойств фермента метанолдегидрогеназы из бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерий Methylobacterium extorquens pCM160 как основы функционирования амперометрического медиаторного биосенсора.
Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Получить бесклеточный экстракт рекомбинантных метилобактерий M.extorquens pCM160 с помощью ультразвукового дезинтегрирования и центрифугирования и установить концентрацию белка в нем;
2. Определить удельную активность фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 в системе медиаторов феназинметасульфат (ФМС) + 2,6- дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ);
3. Изучить спектр окисляемых субстратов бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 спектрофотометрическим и амперометрическим методами ;
4. Определить кинетические параметры фермента МДГ, содержащегося в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам двумя методами - спектрофотометрическим и амперометрическим;
5. Провести сравнительный анализ результатов, полученных спектрофотометрическим и амперометрическим методами.
Род Methylobacteriumявляется одним из наиболее изученных [1] и играет большую роль в научных исследованиях, в частности, для мониторинга уровня токсичных соединений С1 и их последующей биоремедиации [2].
Одной из особенностей метилобактерий является высокая концентрация в периплазматической мембране пирролохинолинхинон (PQQ) - зависимых дегидрогеназ. Основной из них является метанолдегидрогеназа (МДГ) - фермент, катализирующий окисление метанола до формальдегида, а также способный окислять первичные спирты и альдегиды, используя искусственные акцепторы электронов.
Клетки метилобактерий, их бесклеточный экстракт, фермент МДГ могут являться основой при создании биосенсорных систем мониторинга С1 соединений в природных и антропогенно загрязненных экосистемах.
Работа с биосенсорами на основе микроорганизмов часто сопровождается внедрением биокатализаторов (ферментов, ускоряющих реакцию) в процесс анализа [3]. Ими могут быть, например, клетки метилотрофных бактерий, бесклеточный экстракт метилобактерий или фермент МДГ, входящий в их состав . Количество научной литературы, описывающей амперометрические биосенсоры на основе метилобактерий, фермента МДГ и медиаторов электронного транспорта невелико, поэтому применение бесклеточного экстракта метилобактерий в качестве биокатализаторов и разработка на его основе амперометрического медиаторного биосенсора является актуальной задачей.
Целью настоящей работы является изучение биокаталитических свойств фермента метанолдегидрогеназы из бесклеточного экстракта рекомбинантных метилобактерий Methylobacterium extorquens pCM160 как основы функционирования амперометрического медиаторного биосенсора.
Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Получить бесклеточный экстракт рекомбинантных метилобактерий M.extorquens pCM160 с помощью ультразвукового дезинтегрирования и центрифугирования и установить концентрацию белка в нем;
2. Определить удельную активность фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 в системе медиаторов феназинметасульфат (ФМС) + 2,6- дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ);
3. Изучить спектр окисляемых субстратов бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 спектрофотометрическим и амперометрическим методами ;
4. Определить кинетические параметры фермента МДГ, содержащегося в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам двумя методами - спектрофотометрическим и амперометрическим;
5. Провести сравнительный анализ результатов, полученных спектрофотометрическим и амперометрическим методами.
1. Получен бесклеточный экстракт рекомбинантных метилобактерий M.extorquens pCM160 с помощью ультразвукового дезинтегрирования и центрифугирования, масса которого составила 5,6 г. Установлена концентрация белка - 11,042 мг/мл.
2. Определена максимальная удельная активность фермента МДГ в системе медиаторов ФМС+ДХФИФ (0,145 Ед/мг белка).
3. Изучен спектр окисляемых субстратов бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 - муравьиная кислота, щавелевая кислота, метанол, трет-бутанол, изопропанол, этанол, бутанол-1, изоамиловый спирт, глицерин, бензиловый спирт и формальдегид, спектрофотометрическим и амперометрическим методами.
Из субстратной специфичности, определенной спектрофотометрическим методом, видно, что максимальная каталитическая активность наблюдается к метанолу, что согласуется с литературными данными [23]. Такая же тенденция наблюдается и в амперометрическом методе. Также в амперометрическом методе можно заметить снижение каталитической активности фермента с увеличением длины углеводородной цепи субстрата.
4. Определены кинетические параметры фермента МДГ, содержащегося в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам двумя методами - спектрофотометрическим и амперометрическим .
В первом методе (спектрофотометрическом) наименьшая константа Михаэлиса характерна для муравьиной кислоты (0,2±0,1 ммоль/л). В амперометрическом методе высокие коэффициенты чувствительности наблюдаются у метанола и изопропанола (19200±700 и 21200±500 соответственно).
5. Проведен сравнительный анализ результатов, полученных спектрофотометрическим и амперометрическим методами. В субстратной специфичности в обоих методах максимальная окислительная активность
бесклеточного экстракта наблюдается к метанолу, что подтверждается высоким коэффициентом чувствительности на данный субстрат.
Что касается кинетических параметров, исследуемых двумя методами, видно, что в ходе обоих методах максимальная скорость процесса достигается при реакции бесклеточного экстракта с такими субстратами как метанол и изопропанол (в спектрофотометрическом анализе - 0,100±0,003Ед/мг белка и 0,100±0,006Ед/мг белка соответственно; в амперометрическом - 5600±300 нА и 5700±300 нА)
Наименьшая константа Михаэлиса наблюдается у муравьиной кислоты сразу в двух методах исследования (в спектрофотометрическом методе - 0,2±0,1 ммоль/л; в амперометрическом - 0,12±0,02 ммоль/л).
6. Результаты, полученные спектрофотометрическим и амперометрическим методами, могут использоваться для дальнейших исследований в научно-практической деятельности. Фермент МДГ, содержащийся в бесклеточном экстракте рекомбинантных метилотрофных бактерий M.extorquens pCM160 активный, действующий и способный катализировать окисление различных субстратов.
2. Определена максимальная удельная активность фермента МДГ в системе медиаторов ФМС+ДХФИФ (0,145 Ед/мг белка).
3. Изучен спектр окисляемых субстратов бесклеточного экстракта M.extorquens pCM160 - муравьиная кислота, щавелевая кислота, метанол, трет-бутанол, изопропанол, этанол, бутанол-1, изоамиловый спирт, глицерин, бензиловый спирт и формальдегид, спектрофотометрическим и амперометрическим методами.
Из субстратной специфичности, определенной спектрофотометрическим методом, видно, что максимальная каталитическая активность наблюдается к метанолу, что согласуется с литературными данными [23]. Такая же тенденция наблюдается и в амперометрическом методе. Также в амперометрическом методе можно заметить снижение каталитической активности фермента с увеличением длины углеводородной цепи субстрата.
4. Определены кинетические параметры фермента МДГ, содержащегося в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам двумя методами - спектрофотометрическим и амперометрическим .
В первом методе (спектрофотометрическом) наименьшая константа Михаэлиса характерна для муравьиной кислоты (0,2±0,1 ммоль/л). В амперометрическом методе высокие коэффициенты чувствительности наблюдаются у метанола и изопропанола (19200±700 и 21200±500 соответственно).
5. Проведен сравнительный анализ результатов, полученных спектрофотометрическим и амперометрическим методами. В субстратной специфичности в обоих методах максимальная окислительная активность
бесклеточного экстракта наблюдается к метанолу, что подтверждается высоким коэффициентом чувствительности на данный субстрат.
Что касается кинетических параметров, исследуемых двумя методами, видно, что в ходе обоих методах максимальная скорость процесса достигается при реакции бесклеточного экстракта с такими субстратами как метанол и изопропанол (в спектрофотометрическом анализе - 0,100±0,003Ед/мг белка и 0,100±0,006Ед/мг белка соответственно; в амперометрическом - 5600±300 нА и 5700±300 нА)
Наименьшая константа Михаэлиса наблюдается у муравьиной кислоты сразу в двух методах исследования (в спектрофотометрическом методе - 0,2±0,1 ммоль/л; в амперометрическом - 0,12±0,02 ммоль/л).
6. Результаты, полученные спектрофотометрическим и амперометрическим методами, могут использоваться для дальнейших исследований в научно-практической деятельности. Фермент МДГ, содержащийся в бесклеточном экстракте рекомбинантных метилотрофных бактерий M.extorquens pCM160 активный, действующий и способный катализировать окисление различных субстратов.