Исследование таксономической структуры почвенного и ризосферного микробиомов различных сортов Triticum aestivum (Пшеница мягкая) и Secale cereale (Рожь посевная), культивируемых в двух типах почв
Введение 4
Обзор литературы 7
1. История развития исследований микробного сообщества ризосферы.
Ассоциативные микроорганизмы 7
2. Развитие метагеномного подхода к исследованию биоразнообразия 10
3. Биоинформационный анализ данных по таксономической структуре микробиомов 15
4. Особенности исследования ризосферного микробиома 17
5. Современные исследования ризосферного микробиома 18
Материалы и методы исследования 22
1. Объекты исследования 22
2. Методы исследования 23
2.1. Постановка вегетационного опыта 23
2.3. Выделение и очистка ДНК 23
2.3. Биоинформационный анализ данных 24
Результаты и обсуждение 26
1. Биоинформационный анализ результатов секвенирования 26
нуклеотидных последовательностей 26
2. Метагеномная характеристика ризосферного эффекта 31
2.1. Анализ показателей альфа-разнообразия 31
2.2. Анализ показателей бета-разнообразия (кластерный анализ РСоА) 32
2.3. Анализ таксономической структуры сообществ 36
Заключение 42
Выводы 43
Список литературы
Разнообразие микроорганизмов, ассоциированных с корнями растений, огромно и
составляет десятки тысяч видов. Однако лишь недавно была признана колоссальная роль
микробиома в жизни растения и выдвинута идея о рассмотрении его в качестве второго
генома растения (Berendsen et al., 2012). Понимание механизмов формирования и функциональной нагрузки ризосферного микробиома позволит разработать эффективные системы повышения продуктивности растений, обогатит наши знания в области экологии
растительно-микробных взаимодействий.
Первые работы в области растительно-микробных взаимодействий появились около 150 лет назад, большая часть из них была направлена на поиски микробиологических
факторов продуктивности культурных растений. Прежде всего ученых интересовали
азотфиксирующие, рост стимулирующие микроорганизмы, а также патогенная микробиота. Особое внимание уделялось изучению морфологических и физиологических свойств
полученных штаммов и их влияния на растение, предоставляющее ризосферную нишу.
Однако вскоре стало понятно, что в ризосфере существуют так называемые некультивируемые бактерии и археи, присутствие которых невозможно детектировать традиционными методами культивирования на питательных средах (Hugenholtz et al., 1998; Oliver
et al., 2005; Handelsman et al., 2004). Появление новых методов, основанных на секвенировании выделяемых из среды нуклеотидных последовательностей, позволило перейти к
анализу этой многочисленной группы микроорганизмов (по разным оценкам некультивируемые микроорганизмы могут составлять от 90% до 99% состава сообщества). При исследовании некультивируемой части микробного сообщества, объектом исследования
становится метагеном – совокупный генетический материал экосистемы (Vogel et al.,
2009; Riesenfeld et al., 2004). Последующий анализ позволяет в зависимости от задач исследования произвести оценку таксономической и/или функциональной структуры сообщества посредством выбора ген-специфичных праймеров и/или секвенирования полноразмерных геномов. В качестве филогенетического маркера для прокариотов в подавляющем большинстве работ используется структура вариабельных участков гена 16S рРНК.
Использование метагеномных технологий при исследовании сообществ ризосферы
имеет ряд преимуществ, связанных с возможностью более полной детекции состава сообщества, меньшей трудоемкостью и быстротой анализа. Кроме того, метагеномные методы
позволяют проводить исследование биологических объектов на генном и геномном уровне, исследовать метаболические пути, вовлеченные во взаимодействие отдельных компонентов микробного сообщества и предполагать их функции. Все это позволяет постепенно5
выходить на системный уровень понимания закономерностей функционирования почвенных микробных сообществ. В перспективе ожидается появление проектов по комплексному исследованию метагенома, транскриптома, протеома, метаболома, что обеспечит
дальнейшее развитие идеи объединенного анализа.
На данный момент эта тема чрезвычайно актуальна в зарубежной науке – организованы проекты по изучению ризосферного микробиома модельных объектов, таких как
Arabidopsis thaliana, активно изучается ризосферный микробиом сельскохозяйственнозначимых культур – Oryza sativa, Zea mays, Lactuca sativa.
Однако метагеномный подход к исследованию разнообразия находится сегодня на
стадии становления и ставит перед учеными ряд сложных задач, основными из которых
являются воспроизводимость данных секвенирования, зависящая от глубины секвенирования и числа повторностей, а также биологическая интерпретация получаемых результатов. Поскольку метагеномные исследования ризосферного микробиома практически не
представлены в отечественной научной литературе, одной из задач данного исследования
стал анализ воспроизводимости данных высокопроизводительного секвенирования при
проведении такого рода анализа.
Новизна данной работы также обусловлена выбранными объектами исследования -
ризосферными комплексами, наиболее характерными для территории России и состоящими из почв и сортов культурных растений, типичных для российского агропромышленного комплекса (АПК).
Таким образом, целью данной работы является исследование таксономической
структуры почвенного и ризосферного микробиомов различных сортов Triticum aestivum
(Пшеница мягкая) и Secale cereale (Рожь посевная), культивируемых в черноземной и
дерново-подзолистой почвах.
1. Показатели альфа разнообразия снижались в ризосферных почвах по сравнению с контрольными. Достоверные различия в показателях альфа разнообразия были вы-явлены для ризосфер пшеницы на черноземной почве.
2. В ходе анализа бета разнообразия было показано, что определяющее влияние на формирование ризосферного микробиома оказывает тип почвы, вид и сорт расте-ния оказывают заметно меньшее воздействие.
3. В таксономическом составе контрольных почвенных и ризосферных микробиомов
доминировали бактерии из фил Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes,
Acidobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes и археи из филы Crenarchaeota. В сообществе ризосфер обоих растений увеличивалась доля бактерий из фил Proteobacteria и Bacteroidetes.
4. В случае дерново-подзолистой почвы, в ризосфере ржи достоверно увеличивают свою долю микроорганизмы из групп Comamonadaceae, Solirubrobacterales, и Gaiellaceae, в ризосфере пшеницы - Gaiellaceae и неидентифицированные предста-вители класса Acidobacteria-6. Микроорганизмы, относящиеся к группе Acidobacteria-6, также увеличивают свою долю в ризосфере ржи и пшеницы, куль-тивируемых на черноземе.
5. Были обнаружены микроорганизмы, которые достоверно изменяют свою долю как в ризосфере ржи, так и пшеницы среди них бактерии из семейств Oxalobacteraceae, Gaiellaceae и класса Acidobacteria-6. На обоих типах почв наблюдалось снижение доли бактерий из семейства Oxalobacteraceae в почвах ризосферы обоих растений по сравнению с контрольной почвой.
