Помощь студентам в учебе
Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса
|
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА 10
1.1. Эпидемиология сифилиса 10 1.2 Методы лабораторной диагностики сифилиса. 17 1.3. Использование коллоидного серебра в конструировании диагностических тестсистем
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 31
2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу 31
2.2. Питательные среды 31
2.3. Основные химические реактивы и сырье 31
2.4. Аппаратное оснащение исследований 31
2.5. Материалы, полученные из клиник 36
2.6. МИБП и биологичесие препараты 36
2.7. Лабораторные животные, использованные в опытах
2.8. Физико-химические и иммунологические методы 37
2.9. Сублимация МИБП 38
2.10. Статистическая обработка материала 38
Глава 3. СИФИЛИС В РЕСПУБЛИКЕ СЕВЕРНАЯ ОСЕТИЯ-АЛАНИЯ 39
Глава 4. РАЗРАБОТКА ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕННОГО СУСПЕНЗИОННОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА 56
Глава 5. РАЗРАБОТКА ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА С КОЛЛОИДНЫМ СЕРЕБРОМ ДЛЯ ДОТИММУНОАНАЛИЗА 77
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
90
ВЫВОДЫ 98
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100
5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА 10
1.1. Эпидемиология сифилиса 10 1.2 Методы лабораторной диагностики сифилиса. 17 1.3. Использование коллоидного серебра в конструировании диагностических тестсистем
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 31
2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу 31
2.2. Питательные среды 31
2.3. Основные химические реактивы и сырье 31
2.4. Аппаратное оснащение исследований 31
2.5. Материалы, полученные из клиник 36
2.6. МИБП и биологичесие препараты 36
2.7. Лабораторные животные, использованные в опытах
2.8. Физико-химические и иммунологические методы 37
2.9. Сублимация МИБП 38
2.10. Статистическая обработка материала 38
Глава 3. СИФИЛИС В РЕСПУБЛИКЕ СЕВЕРНАЯ ОСЕТИЯ-АЛАНИЯ 39
Глава 4. РАЗРАБОТКА ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕННОГО СУСПЕНЗИОННОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА 56
Глава 5. РАЗРАБОТКА ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА С КОЛЛОИДНЫМ СЕРЕБРОМ ДЛЯ ДОТИММУНОАНАЛИЗА 77
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
90
ВЫВОДЫ 98
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100
Сифилис - болезнь оборотень, хамелеон, грозная с хроническим волнообразным течением, способная проявить себя множеством кожных симптомов, поражающая практически все органы и ткани, в глубоком смысле
- нейроинфекция, протекающая без особых ощущений для больного, который, находя массу отговорок и объяснений проявлениям её, не обращается к специалисту. Сифилис способен сбить с толку многих врачей не венерологов и требует к себе отношения по принципу - всякая сыпь на коже считается сифилисом,пока не доказано обратное. Необходимо отметить, что заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП), и в частности сифилис, способствуют распространению такого смертельно опасного заболевания как ВИЧ-инфекция.
По статистике Минздрава РФ, в России в 2002 г. зарегистрировано 1,047 млн. случаев ЗППП, в том числе 207 тыс. 157 случаев заболевания сифилисом. Заболеваемость сифилисом в России остается крайне высокой и составляет более 143 случаев на 100 тыс. населения. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза. За про¬шедший год зарегистрировано свыше 52 тыс. больных ЗППП в возрасте до 17 лет. У девочек до 14 лет показатель заболеваемости сифилисом по сравнению с 1990 г. возрос в 85 раз. Проведенный в 37 субъектах России анализ путей заражения сифилисом показал, что в 60 % случаев дети заразились половым путем. В таких условиях большое значение приобретает своевременная диагностика данного заболевания, основанная на высоко¬чувствительных и высокоспецифичных реакциях. Особая роль при этом должна отводиться методам массового профилактического обследования населения (скрининга) с целью раннего выявления инфекции, что также диктует необходимость повышения требований к чувствительности и специфичности экспрессных тестов на сифилис (Овчинников Н.М., Беднова, В.Н., Делекторский В.В., 1987; Дмитриев Г.А., 1996; Ткачев В.К., 1997; Сухова Л.П., Машеро В.В., Войнова Н.Н., 1999, Онищенко Г.Г.,2002; Jo- honson P.C., Farnie M.A., 1994; Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolf A.N., 1995; Young H., 1998).
В лабораторной практике используют комплекс серологических реакций (КСР), включающий отборочную реакцию микропреципитации (МР) с кардиолипиновым антигеном и стандартные серологические реакции - реакцию связывания комплемента (РСК) с кардиолипиновым и трепонемным антигенами. Кроме того, ставят специфические реакции - иммунофлуоресценции (РИФ) и её модификации (РИФ- абс, РИФ - 200), реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), иммуноферментный анализ (ИФА). При этом не все вышеуказанные тесты равнозначны по чувствительности и специфичности из-за разных причин: использование неспецифического кардиолипинового антигена, наличия в исследуемом материале антител к общим антигенам спирохет, перекрестные реакции при других заболеваниях и определенных физиологических состояниях организма.
Поэтому в зоне внимания исследователей постоянно находятся проблемы совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики сифилиса с целью расширения арсенала диагностикумов и повышения их качества.
Цель и основные задачи исследования
Цель диссертационной работы - разработка биотехнологии получения новых эффективных специфичных трепонемных иммунпрепаратов и оценка их пригодности для использования в диагностике сифилиса.
Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:
- провести анализ заболеваемости и лабораторной диагностики сифилиса в Республике Северная Осетия-Алания;
- получить высокоспецифичный полноценный комплексный трепонемный антиген для использования его при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП);
- разработать биотехнологию получения трепонемного антигенного диагностикума на основе полимерной матрицы - латекса для экспресс- диагностики сифилиса в реакции агглютинации (РАЛ);
- разработать трепонемный суспензионный антигенный диагностикум с коллоидным серебром для дот-иммуноанализа (ДИА);
- провести лабораторные и клинические испытания разработанных трепонемных иммунодиагностикумов.
Научная новизна работы
Впервые представлены данные об особенностях эпидемиологии сифилиса в Республике Северная Осетия-Алания за последние пять лет. Методом эпидемиологического районирования определены тенденции распространения этой инфекции и причины высокой заболеваемости в от¬дельных районах Республики, которые выше многих территориальных показателей по Российской Федерации.
Разработана высокоэффективная схема получения комплексного трепонемного антигена, который использован в качестве лиганда при конструировании иммунодиагностикумов.
Получен трепонемный суспензионный антигенный латексный диагностикум, характеризующийся высокой чувствительностью и специфичностью.
- нейроинфекция, протекающая без особых ощущений для больного, который, находя массу отговорок и объяснений проявлениям её, не обращается к специалисту. Сифилис способен сбить с толку многих врачей не венерологов и требует к себе отношения по принципу - всякая сыпь на коже считается сифилисом,пока не доказано обратное. Необходимо отметить, что заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП), и в частности сифилис, способствуют распространению такого смертельно опасного заболевания как ВИЧ-инфекция.
По статистике Минздрава РФ, в России в 2002 г. зарегистрировано 1,047 млн. случаев ЗППП, в том числе 207 тыс. 157 случаев заболевания сифилисом. Заболеваемость сифилисом в России остается крайне высокой и составляет более 143 случаев на 100 тыс. населения. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза. За про¬шедший год зарегистрировано свыше 52 тыс. больных ЗППП в возрасте до 17 лет. У девочек до 14 лет показатель заболеваемости сифилисом по сравнению с 1990 г. возрос в 85 раз. Проведенный в 37 субъектах России анализ путей заражения сифилисом показал, что в 60 % случаев дети заразились половым путем. В таких условиях большое значение приобретает своевременная диагностика данного заболевания, основанная на высоко¬чувствительных и высокоспецифичных реакциях. Особая роль при этом должна отводиться методам массового профилактического обследования населения (скрининга) с целью раннего выявления инфекции, что также диктует необходимость повышения требований к чувствительности и специфичности экспрессных тестов на сифилис (Овчинников Н.М., Беднова, В.Н., Делекторский В.В., 1987; Дмитриев Г.А., 1996; Ткачев В.К., 1997; Сухова Л.П., Машеро В.В., Войнова Н.Н., 1999, Онищенко Г.Г.,2002; Jo- honson P.C., Farnie M.A., 1994; Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolf A.N., 1995; Young H., 1998).
В лабораторной практике используют комплекс серологических реакций (КСР), включающий отборочную реакцию микропреципитации (МР) с кардиолипиновым антигеном и стандартные серологические реакции - реакцию связывания комплемента (РСК) с кардиолипиновым и трепонемным антигенами. Кроме того, ставят специфические реакции - иммунофлуоресценции (РИФ) и её модификации (РИФ- абс, РИФ - 200), реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), иммуноферментный анализ (ИФА). При этом не все вышеуказанные тесты равнозначны по чувствительности и специфичности из-за разных причин: использование неспецифического кардиолипинового антигена, наличия в исследуемом материале антител к общим антигенам спирохет, перекрестные реакции при других заболеваниях и определенных физиологических состояниях организма.
Поэтому в зоне внимания исследователей постоянно находятся проблемы совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики сифилиса с целью расширения арсенала диагностикумов и повышения их качества.
Цель и основные задачи исследования
Цель диссертационной работы - разработка биотехнологии получения новых эффективных специфичных трепонемных иммунпрепаратов и оценка их пригодности для использования в диагностике сифилиса.
Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:
- провести анализ заболеваемости и лабораторной диагностики сифилиса в Республике Северная Осетия-Алания;
- получить высокоспецифичный полноценный комплексный трепонемный антиген для использования его при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП);
- разработать биотехнологию получения трепонемного антигенного диагностикума на основе полимерной матрицы - латекса для экспресс- диагностики сифилиса в реакции агглютинации (РАЛ);
- разработать трепонемный суспензионный антигенный диагностикум с коллоидным серебром для дот-иммуноанализа (ДИА);
- провести лабораторные и клинические испытания разработанных трепонемных иммунодиагностикумов.
Научная новизна работы
Впервые представлены данные об особенностях эпидемиологии сифилиса в Республике Северная Осетия-Алания за последние пять лет. Методом эпидемиологического районирования определены тенденции распространения этой инфекции и причины высокой заболеваемости в от¬дельных районах Республики, которые выше многих территориальных показателей по Российской Федерации.
Разработана высокоэффективная схема получения комплексного трепонемного антигена, который использован в качестве лиганда при конструировании иммунодиагностикумов.
Получен трепонемный суспензионный антигенный латексный диагностикум, характеризующийся высокой чувствительностью и специфичностью.
В последнее время насчитывается более 20 инфекций, передаваемых половым путем, среди которых сифилис занимает значительное место. Заболеваемость сифилисом в России остается крайне высокой и составляет более 143 случаев на 100 тыс. населения. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза, причем её подъем имеет многие признаки эпидемии: преобладают в структуре свежие формы; про¬исходит рост числа детей с врожденным и приобретенным бытовым сифилисом; появились территории с показателями заболеваемости, значительно превышающими статистические показатели по стране (Аковбян В. А., Про- хоренков В.И., Машкиляйсон А.Л. и др. 1995; Адаскевич В.П., 1999; Родио¬нов А.Н., 2000).
Республика Северная Осетия-Алания является регионом, где наряду с общероссийскими проблемами (увеличение числа социально неадаптированных лиц, более раннее начало половой жизни, рост проституции и др.), имеются и свои особенности, главными из которых являются высокая плотность населения, приближенность к "горячим точкам", наличие большого количества беженцев и вынужденных переселенцев, выраженность миграционных процессов.
Анализируя заболеваемость сифилисом в РСО - А по районам за пять лет, можно отметить, что она носит циклический характер, во всех районах и в г. Владикавказе наблюдается её нестабильность, со «взлётами» и «падениями». Так, подъем заболеваемости в 2003 г. (43,0 на 100 тыс.) произошёл за счёт увеличения случаев сифилиса в Пригородном (в 2 раза), Ардонском (в 2,5 раза), Кировском (более чем в 3 раза) и Алагирском (почти в 5 раз) районах. В других районах Республики и в г. Владикавказе наблюдалось некоторое снижение заболеваемости.
91
С 1999 г. по 2003 г. стало заметно изменение удельного веса различных форм сифилиса в сторону увеличения раннего (с 43,5% до 56,0%), появления позднего скрытого сифилиса (5,8%) и врожденного сифилиса (1,7%). С 2001 г. отмечены случаи нейросифилиса. В структуре заболеваемости превалируют скрытые формы сифилиса, которые характеризуются полным отсутствием симптоматики и выявляются только по положительным серологическим ре¬акциям при обследовании крови в поликлиниках, стационарах, при устройстве на работу и различных профилактических осмотрах.
Основную массу больных сифилисом составляют лица обоих полов в возрасте от 20 до 39 лет. Однако в последнее время отмечается тенденция к увеличению удельного веса лиц в возрасте свыше 40 лет. По семейному положению основную массу больных составляют лица разведённые (5%), со¬стоящие в браке повторно (13,0%) и холостые (60%), т.е. семья является од¬ним из сдерживающих факторов в предупреждении случайных половых связей. Анализ социального состава больных сифилисом показал, что основная масса больных (78,9%) представлена нигде не работающими лицами, что в значительной мере затрудняет проведение противоэпидемических мероприятий. Среди причин, влияющих на заболеваемость, необходимо отметить возросшую сексуальную активность подростков, увеличение числа вне- и до¬брачных половых связей вследствие возросшей сексуальной раскрепощённости населения, коммерциализацию интимных отношений, широкое распространение порнографии, наркомании и т. д.
Таким образом, анализ заболеваемости сифилисом в Республике Се¬верная Осетия-Алания свидетельствует о высокой тенденции распространения этого заболевания. Это обусловливает необходимость разработки и интенсивного проведения противоэпидемических мероприятий как в неблагополучных районах, так и в целом по Республике. При этом лабораторные методы играют существенную роль в системе этих мероприятий.
В централизованной лаборатории Северо-Осетинского кожновенерологического диспансера во исполнение приказа МЗ № 87 с 2001 г. для исследования на сифилис широко применяются: тест быстрых плазменных реагинов (RPR), метод иммуноферментного анализа (ИФА), как скрининговый, трепонемные подтверждающие тесты - реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ), позволившие выявить большее количество поздних форм сифилиса: в 2000 г. поздний скрытый сифилис был в 2-х, в 2002 г. - уже в 4-х случаях; в 2000 г. нейросифилис не обнаруживался, а в 2002 г. - уже диагностировали 7 случаев этой тяжёлой формы болезни. Необходимо отметить, что в 12,4% случаях при установлении диагноза раннего скрытого сифилиса и 50,0% - при нейросифилисе при отрицательной реакции Вассермана ИФА была резко положительной.
Республика Северная Осетия-Алания является регионом, где наряду с общероссийскими проблемами (увеличение числа социально неадаптированных лиц, более раннее начало половой жизни, рост проституции и др.), имеются и свои особенности, главными из которых являются высокая плотность населения, приближенность к "горячим точкам", наличие большого количества беженцев и вынужденных переселенцев, выраженность миграционных процессов.
Анализируя заболеваемость сифилисом в РСО - А по районам за пять лет, можно отметить, что она носит циклический характер, во всех районах и в г. Владикавказе наблюдается её нестабильность, со «взлётами» и «падениями». Так, подъем заболеваемости в 2003 г. (43,0 на 100 тыс.) произошёл за счёт увеличения случаев сифилиса в Пригородном (в 2 раза), Ардонском (в 2,5 раза), Кировском (более чем в 3 раза) и Алагирском (почти в 5 раз) районах. В других районах Республики и в г. Владикавказе наблюдалось некоторое снижение заболеваемости.
91
С 1999 г. по 2003 г. стало заметно изменение удельного веса различных форм сифилиса в сторону увеличения раннего (с 43,5% до 56,0%), появления позднего скрытого сифилиса (5,8%) и врожденного сифилиса (1,7%). С 2001 г. отмечены случаи нейросифилиса. В структуре заболеваемости превалируют скрытые формы сифилиса, которые характеризуются полным отсутствием симптоматики и выявляются только по положительным серологическим ре¬акциям при обследовании крови в поликлиниках, стационарах, при устройстве на работу и различных профилактических осмотрах.
Основную массу больных сифилисом составляют лица обоих полов в возрасте от 20 до 39 лет. Однако в последнее время отмечается тенденция к увеличению удельного веса лиц в возрасте свыше 40 лет. По семейному положению основную массу больных составляют лица разведённые (5%), со¬стоящие в браке повторно (13,0%) и холостые (60%), т.е. семья является од¬ним из сдерживающих факторов в предупреждении случайных половых связей. Анализ социального состава больных сифилисом показал, что основная масса больных (78,9%) представлена нигде не работающими лицами, что в значительной мере затрудняет проведение противоэпидемических мероприятий. Среди причин, влияющих на заболеваемость, необходимо отметить возросшую сексуальную активность подростков, увеличение числа вне- и до¬брачных половых связей вследствие возросшей сексуальной раскрепощённости населения, коммерциализацию интимных отношений, широкое распространение порнографии, наркомании и т. д.
Таким образом, анализ заболеваемости сифилисом в Республике Се¬верная Осетия-Алания свидетельствует о высокой тенденции распространения этого заболевания. Это обусловливает необходимость разработки и интенсивного проведения противоэпидемических мероприятий как в неблагополучных районах, так и в целом по Республике. При этом лабораторные методы играют существенную роль в системе этих мероприятий.
В централизованной лаборатории Северо-Осетинского кожновенерологического диспансера во исполнение приказа МЗ № 87 с 2001 г. для исследования на сифилис широко применяются: тест быстрых плазменных реагинов (RPR), метод иммуноферментного анализа (ИФА), как скрининговый, трепонемные подтверждающие тесты - реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ), позволившие выявить большее количество поздних форм сифилиса: в 2000 г. поздний скрытый сифилис был в 2-х, в 2002 г. - уже в 4-х случаях; в 2000 г. нейросифилис не обнаруживался, а в 2002 г. - уже диагностировали 7 случаев этой тяжёлой формы болезни. Необходимо отметить, что в 12,4% случаях при установлении диагноза раннего скрытого сифилиса и 50,0% - при нейросифилисе при отрицательной реакции Вассермана ИФА была резко положительной.
Подобные работы
- РАЗРАБОТКА СУСПЕНЗИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССНОЙ ИММУНОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА
Диссертация , биология. Язык работы: Русский. Цена: 500 р. Год сдачи: 2004 - Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза
Диссертации (РГБ), биология. Язык работы: Русский. Цена: 500 р. Год сдачи: 2005 - РАЗРАБОТКА СУСПЕНЗИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЭКС-ПРЕССНОЙ ИММУНОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА
Диссертации (РГБ), медицина . Язык работы: Русский. Цена: 700 р. Год сдачи: 2004