Помощь студентам в учебе
Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот и тонких органических пленок
|
Введение 10
Цель и задачи исследования 12
Обзор литературы 14
1. Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии 14
1.1. Общие принципы работы сканирующего зондового микроскопа 15
1.2. Сканирующая туннельная микроскопия 17
1.3. Атомно-силовая микроскопия 18
1.3.1. Силовое взаимодействие зонда и образца 18
1.3.2. Принцип работы АСМ 22
1.4. Основные методы исследования биологических и органических объектов и структур 33
1.5. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот 38
1.5.1. Основные методики препарирования образцов для зондовой микроскопии нуклеиновых кислот .... 39
1.5.2. Применение зондовой микроскопии для исследования структуры и свойств молекул нуклеиновых кислот и их комплексов 46
Теоретическая часть 50
2. Анализ искажающих эффектов атомно-силовой микроскопии 50
2.1. Контактные деформации зонда и образца 50
2.1.1. Контакт двух тел: решение контактной задачи Герца 51
2.1.2. Контакт сферического зонда и сферического образца 54
1
2.1.3. Контакт сферического зонда и цилиндрического образца 59
2.1.4. Динамика переходного процесса контактных деформаций 71
2.1.5. Возможность достижения атомного разрешения с помощью ACM 72
2.2. Задача восстановления реальной геометрии объектов по
ACM-изображению (учет эффекта уширения) 85
2.2.1. Постановка и решение задачи об определении ширины объектов по измеренным параметрам ACM- профиля 88
Экспериментальная часть 95
3. АСМ-исследования взаимодействия вирусной РНК с белками 95
3.1. Исследование процессов разрушения белковой оболочки частиц вируса табачной мозаики и высвобождения вирус¬ной РНК 95
3.1.1. Результаты и их обсуждение 100
3.1.2. Анализ распределения молекул РНК по длинам . . 109
3.1.3. Краткие выводы 118
4. Зондовая микроскопия процессов конденсации ДНК 120
4.1. Исследование конформационных изменений ДНК при взаимодействии с поверхностно-активными веществами . . 124
4.1.1. Возможность исследования конформационных свойств комплексов ДНК-ПАВ методом CTM . . .127
4.1.2. Определение геометрии комплексов ДНК-ПАВ, перешедших через границу раздела фаз вода/хлороформ, по результатам ACM 129
4.2. Исследование изменений конформации ДНК в водноспиртовых средах 138
4.2.1. Исследование сконденсированных в водно-спиртовой
среде молекул ДНК при проведении исследований на воздухе 139
2
4.2.2. Исследование процессов конденсации ДНК непосредственно в водно-спиртовой среде 141
4.2.3. Краткие выводы 151
5. Применение метода АСМ для анализа структуры тонких органических пленок 152
5.1. Влияние процессов внедрения CdTe-кластеров на структуру тонкопленочных покрытий бегеновой кислоты 157
5.1.1. Экспериментальная часть 158
5.1.2. Результаты и их обсуждение 159
5.2. Исследование тонких пленок белков 172
5.3. Исследование влияния условий формирования покрытий и природы подложки на молекулярную упаковку тонких
органических пленок 177
5.3.1. Результаты исследований молекулярной упаковки
тонких пленок 189
Заключение 202
Выводы 205
Благодарность 206
Библиография 206 A. Приложение 220
A.1. Программа, реализующая численное решение задачи о
контактных деформациях зонда и цилиндрического образца220 A.2. Программа, реализующая численное решение задачи вос¬становления реальной геометрии объекта по измеренному
АСМ-профилю 223
A.3. Параметры промышленных кантилеверов 226
3
Цель и задачи исследования 12
Обзор литературы 14
1. Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии 14
1.1. Общие принципы работы сканирующего зондового микроскопа 15
1.2. Сканирующая туннельная микроскопия 17
1.3. Атомно-силовая микроскопия 18
1.3.1. Силовое взаимодействие зонда и образца 18
1.3.2. Принцип работы АСМ 22
1.4. Основные методы исследования биологических и органических объектов и структур 33
1.5. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот 38
1.5.1. Основные методики препарирования образцов для зондовой микроскопии нуклеиновых кислот .... 39
1.5.2. Применение зондовой микроскопии для исследования структуры и свойств молекул нуклеиновых кислот и их комплексов 46
Теоретическая часть 50
2. Анализ искажающих эффектов атомно-силовой микроскопии 50
2.1. Контактные деформации зонда и образца 50
2.1.1. Контакт двух тел: решение контактной задачи Герца 51
2.1.2. Контакт сферического зонда и сферического образца 54
1
2.1.3. Контакт сферического зонда и цилиндрического образца 59
2.1.4. Динамика переходного процесса контактных деформаций 71
2.1.5. Возможность достижения атомного разрешения с помощью ACM 72
2.2. Задача восстановления реальной геометрии объектов по
ACM-изображению (учет эффекта уширения) 85
2.2.1. Постановка и решение задачи об определении ширины объектов по измеренным параметрам ACM- профиля 88
Экспериментальная часть 95
3. АСМ-исследования взаимодействия вирусной РНК с белками 95
3.1. Исследование процессов разрушения белковой оболочки частиц вируса табачной мозаики и высвобождения вирус¬ной РНК 95
3.1.1. Результаты и их обсуждение 100
3.1.2. Анализ распределения молекул РНК по длинам . . 109
3.1.3. Краткие выводы 118
4. Зондовая микроскопия процессов конденсации ДНК 120
4.1. Исследование конформационных изменений ДНК при взаимодействии с поверхностно-активными веществами . . 124
4.1.1. Возможность исследования конформационных свойств комплексов ДНК-ПАВ методом CTM . . .127
4.1.2. Определение геометрии комплексов ДНК-ПАВ, перешедших через границу раздела фаз вода/хлороформ, по результатам ACM 129
4.2. Исследование изменений конформации ДНК в водноспиртовых средах 138
4.2.1. Исследование сконденсированных в водно-спиртовой
среде молекул ДНК при проведении исследований на воздухе 139
2
4.2.2. Исследование процессов конденсации ДНК непосредственно в водно-спиртовой среде 141
4.2.3. Краткие выводы 151
5. Применение метода АСМ для анализа структуры тонких органических пленок 152
5.1. Влияние процессов внедрения CdTe-кластеров на структуру тонкопленочных покрытий бегеновой кислоты 157
5.1.1. Экспериментальная часть 158
5.1.2. Результаты и их обсуждение 159
5.2. Исследование тонких пленок белков 172
5.3. Исследование влияния условий формирования покрытий и природы подложки на молекулярную упаковку тонких
органических пленок 177
5.3.1. Результаты исследований молекулярной упаковки
тонких пленок 189
Заключение 202
Выводы 205
Благодарность 206
Библиография 206 A. Приложение 220
A.1. Программа, реализующая численное решение задачи о
контактных деформациях зонда и цилиндрического образца220 A.2. Программа, реализующая численное решение задачи вос¬становления реальной геометрии объекта по измеренному
АСМ-профилю 223
A.3. Параметры промышленных кантилеверов 226
3
Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ), объединяющая широкий спектр современных методов исследования поверхности, насчитывает полтора десятка лет своей истории — с момента создания в 1981 г. Биннигом и Рорером сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) [1, 2]. За прошедшие годы применение зондовой микроскопии позволило достичь уникальных научных результатов в различных областях физики, химии и биологии. Наиболее яркими демонстрациями возможностей этого экспериментального направления при исследовании поверхностей твердых тел могут служить: результаты по прямой визуализации реконструкции поверхностей [3]^, манипуляция отдельными атомами для записи информации с рекордной плотностью, исследование локального влияния поверхностных дефектов на зонную структуру образца [4] и пр.
Новые экспериментальные возможности рассматриваемого направления в сравнении с традиционными методами исследования поверхности делают особенно перспективным применение зондовой микроскопии (в частности атомно-силовой микроскопии (АСМ) [5]) для изучения биологических и органических материалов. На этом пути в последние годы также был достигнут значительный прогресс. В частности, применительно к исследованиям нуклеиновых кислот, можно упомянуть о таких результатах, как визуализация отдельных молекул ДНК [6] и исследование их конформационного состояния в жидких средах, прямое измерение сил взаимодействия комплементарных нуклеотидов [7], визуализация в реальном масштабе времени процессов взаимодействия ДНК с белка¬ми [8].
В то же время зондовая микроскопия биологических и органических объектов и структур остается более сложной задачей в сравнении с СЗМ-анализом поверхностей твердых тел. Действительно, прошло более
^ например, поверхности Si(111)7 х 7
10
десяти лет с момента возникновения СЗМ, прежде чем была убедительно показана ее адекватность для исследований биообъектов (в 1992 г. на примере молекулы ДНК [6]). Это связано с такими особенностями подобных объектов, как низкая проводимость2^ и невысокая механическая жесткость. Актуальной является проблема иммобилизации данных структур на поверхностях твердых подложек в процессах приготовления образцов и при исследованиях (особенно в жидких средах). Важно, что¬бы объекты были зафиксированы на подложке в таком состоянии, чтобы было возможно исследовать их интересующие структурные особенности. Возможным подходом к решению этой задачи может служить, например, модификация свойств подложки путем контролируемого осаждения на ее поверхность тонких органических пленок с заданными свойствами.
Весьма важным для адекватного применения зондовых микроскопов в широкомасштабных научных исследованиях является отслеживание и систематизация возможных механизмов возникновения артефактов, т.е. аппаратных эффектов, приводящих к наблюдению ложных или искаженных свойств исследуемого объекта, которое может быть обусловлено, например, воздействием на объект самого инструмента исследования и пр.
Действительно, сканирующий зондовый микроскоп представляет собой «проектор», проецирующий объекты и явления микромира на доступный нашему восприятию «экран» — в силу многих причин удобно, чтобы им служил экран монитора компьютера. В этом случае проекция становиться отчасти «осязаемой», поскольку допускает возможность дополнительного анализа с помощью соответствующего программного обеспечения. Однако подобное «проецирование» несет только частичную информацию об объекте, к тому же отчасти искаженную влиянием самого «проектора». Восстановление по проекции реальных свойств ис-следуемых объектов является типичной обратной задачей, требующей решения и для зондовой микроскопии.
Новые экспериментальные возможности рассматриваемого направления в сравнении с традиционными методами исследования поверхности делают особенно перспективным применение зондовой микроскопии (в частности атомно-силовой микроскопии (АСМ) [5]) для изучения биологических и органических материалов. На этом пути в последние годы также был достигнут значительный прогресс. В частности, применительно к исследованиям нуклеиновых кислот, можно упомянуть о таких результатах, как визуализация отдельных молекул ДНК [6] и исследование их конформационного состояния в жидких средах, прямое измерение сил взаимодействия комплементарных нуклеотидов [7], визуализация в реальном масштабе времени процессов взаимодействия ДНК с белка¬ми [8].
В то же время зондовая микроскопия биологических и органических объектов и структур остается более сложной задачей в сравнении с СЗМ-анализом поверхностей твердых тел. Действительно, прошло более
^ например, поверхности Si(111)7 х 7
10
десяти лет с момента возникновения СЗМ, прежде чем была убедительно показана ее адекватность для исследований биообъектов (в 1992 г. на примере молекулы ДНК [6]). Это связано с такими особенностями подобных объектов, как низкая проводимость2^ и невысокая механическая жесткость. Актуальной является проблема иммобилизации данных структур на поверхностях твердых подложек в процессах приготовления образцов и при исследованиях (особенно в жидких средах). Важно, что¬бы объекты были зафиксированы на подложке в таком состоянии, чтобы было возможно исследовать их интересующие структурные особенности. Возможным подходом к решению этой задачи может служить, например, модификация свойств подложки путем контролируемого осаждения на ее поверхность тонких органических пленок с заданными свойствами.
Весьма важным для адекватного применения зондовых микроскопов в широкомасштабных научных исследованиях является отслеживание и систематизация возможных механизмов возникновения артефактов, т.е. аппаратных эффектов, приводящих к наблюдению ложных или искаженных свойств исследуемого объекта, которое может быть обусловлено, например, воздействием на объект самого инструмента исследования и пр.
Действительно, сканирующий зондовый микроскоп представляет собой «проектор», проецирующий объекты и явления микромира на доступный нашему восприятию «экран» — в силу многих причин удобно, чтобы им служил экран монитора компьютера. В этом случае проекция становиться отчасти «осязаемой», поскольку допускает возможность дополнительного анализа с помощью соответствующего программного обеспечения. Однако подобное «проецирование» несет только частичную информацию об объекте, к тому же отчасти искаженную влиянием самого «проектора». Восстановление по проекции реальных свойств ис-следуемых объектов является типичной обратной задачей, требующей решения и для зондовой микроскопии.
Целью проведенных исследований служила разработка зондово- микроскопических методов исследования нуклеиновых кислот. Попутно, при решении задач контролируемой модификации свойств подложки для иммобилизации нуклеиновых кислот, были затронуты вопросы, связанные с тонкими органическими пленками: выяснение основных механизмов, определяющих структуру покрытия.
Исследования органических пленок, сформированных по технологии ЛБ, показали, что они являются весьма перспективным объектом для СЗМ-анализа, поскольку методы зондовой микроскопии могут позволить получить здесь принципиально новую информацию. Поэтому мы провели ряд исследований тонкопленочных покрытий (глава 5) в которых эти структуры являлись основным объектом исследования (безотносительно к нуклеиновым кислотам). В экспериментах мы анализировали влияние процедуры выделения пленки, состава субфазы и природы подложки как на микроструктуру пленки (дефектность и однородность на микронных размерах поверхности), так и на молекулярную упаковку молекул в сформированных покрытиях.
Возможность достижения молекулярного разрешения при исследовании плоских поверхностей (тонких пленок, кристаллических подложек), и невозможность достижения столь же высокого латерального пространственного разрешения в исследованиях нуклеиновых кислот и вирусных частиц, требовали объяснения. Вопрос о механизме достижения «атомного» разрешения в АСМ возник и в свете результатов применения теории контактных деформаций для описания контакта зонда и образца (раздел 2.1 — учет эффекта занижения высот АСМ-изображений объектов). Действительно, согласно соотношениям Герца этой теории, размер области контакта зонда и образца при типичных условиях АСМ- исследований на воздухе составляет единицы квадратных нанометров и значительно превышает, например, типичную площадь на молекулу в ЛБ пленках ~ 0,2 нм2. В разделе2.1.5 механизм АСМ-визуализации атомной структуры поверхности был обоснован с позиций контактной теории, что позволило объяснить ряд экспериментально наблюдаемых закономерностей.
С использованием соотношений Герца удалось разработать методику определения упругих параметров отдельных микрообъектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки. Эта методика нашла отражение в экспериментальной части задачи31) «Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот» специального физического практикума по зондовой микроскопии кафедры физики полимеров и кристаллов физического факультета МГУ.
Исследования органических пленок, сформированных по технологии ЛБ, показали, что они являются весьма перспективным объектом для СЗМ-анализа, поскольку методы зондовой микроскопии могут позволить получить здесь принципиально новую информацию. Поэтому мы провели ряд исследований тонкопленочных покрытий (глава 5) в которых эти структуры являлись основным объектом исследования (безотносительно к нуклеиновым кислотам). В экспериментах мы анализировали влияние процедуры выделения пленки, состава субфазы и природы подложки как на микроструктуру пленки (дефектность и однородность на микронных размерах поверхности), так и на молекулярную упаковку молекул в сформированных покрытиях.
Возможность достижения молекулярного разрешения при исследовании плоских поверхностей (тонких пленок, кристаллических подложек), и невозможность достижения столь же высокого латерального пространственного разрешения в исследованиях нуклеиновых кислот и вирусных частиц, требовали объяснения. Вопрос о механизме достижения «атомного» разрешения в АСМ возник и в свете результатов применения теории контактных деформаций для описания контакта зонда и образца (раздел 2.1 — учет эффекта занижения высот АСМ-изображений объектов). Действительно, согласно соотношениям Герца этой теории, размер области контакта зонда и образца при типичных условиях АСМ- исследований на воздухе составляет единицы квадратных нанометров и значительно превышает, например, типичную площадь на молекулу в ЛБ пленках ~ 0,2 нм2. В разделе2.1.5 механизм АСМ-визуализации атомной структуры поверхности был обоснован с позиций контактной теории, что позволило объяснить ряд экспериментально наблюдаемых закономерностей.
С использованием соотношений Герца удалось разработать методику определения упругих параметров отдельных микрообъектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки. Эта методика нашла отражение в экспериментальной части задачи31) «Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот» специального физического практикума по зондовой микроскопии кафедры физики полимеров и кристаллов физического факультета МГУ.