Помощь студентам в учебе
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОРНЕВОГО РАКА ПЛОДОВЫХ САЖЕНЦЕВ Pseudomonas tumefaciens (SMITH AND TOWNSEND)
|
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Возбудитель корневого рака 8
1.2 История изучения возбудителя корневого рака 10
1.3 Симптомы корневого рака 12
1.4 Меры борьбы с корневым раком 14
1.4.1 Профилактические мероприятия против корневого рака 16
1.4.2 Подготовка посадочного материала 17
1.4.3 Контроль качества посадочного материала 17
1.4.4 Закладка маточника 18
1.4.5 Профилактические работы после закладки маточника 18
1.4.6 Карантин 19
1.4.7 Изоляция и посадка отводков в оздоровленном
маточнике 19
1.5 Идентификация возбудителя корневого рака 19
1.5.1 Выделение в чистую культуру и идентификация
Pseudomonas tumefaciens 20
1.5.2 Идентификация возбудителя корневого рака методом
растений-индикаторов 21
1.5.3 Идентификация возбудителя корневого рака методом
ПЦР-анализа 22
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 24
2.1. Материалы исследования 24
2.2. Методы исследования 25
2.2.1. Подготовка и стерилизация лабораторной посуды 25
2.2.2. Приготовление питательных сред для выделения и
культивирования микроорганизмов 26
2.2.3 Подготовка материала к посеву 27
2.2.4 Выделение возбудителя корневого рака в чистую и
накопительную культуры из опухоли растения 28
2.2.5 Определение характеристик колоний выделенных
микроорганизмов 29
2.2.5.1. Определение цвета колоний выделенных
микроорганизмов 29
2.2.5.2. Определение консистенции колоний и особенностей
роста колоний 29
2.2.5.3 Определение характера роста колоний 30
2.2.5.4 Определение типа дыхания выделенных
микроорганизмов 31
2.2.6 Определение характеристик микроскопического
препарата 31
2.2.6.1 Определение наличия спор 32
2.2.6.2 Окраска по Граму 33
2.2.6.3 Определение размера микробной клетки 34
2.2.6.4Определение подвижности выделенных
микроорганизмов 35
2.2.7 Выявление роста возбудителя на дисках моркови 36
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
3.1. Выделение возбудителя корневого рака в чистую
культуру 38
3.2. Идентификация возбудителя корневого рака на основании
морфологии колоний 39
3.3. Идентификация возбудителя корневого рака на основании
исследования микроскопических препаратов 41
3.4. Тестирование выделенных микроорганизмов на дисках
моркови 45
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 50
ПРИЛОЖЕНИЯ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Возбудитель корневого рака 8
1.2 История изучения возбудителя корневого рака 10
1.3 Симптомы корневого рака 12
1.4 Меры борьбы с корневым раком 14
1.4.1 Профилактические мероприятия против корневого рака 16
1.4.2 Подготовка посадочного материала 17
1.4.3 Контроль качества посадочного материала 17
1.4.4 Закладка маточника 18
1.4.5 Профилактические работы после закладки маточника 18
1.4.6 Карантин 19
1.4.7 Изоляция и посадка отводков в оздоровленном
маточнике 19
1.5 Идентификация возбудителя корневого рака 19
1.5.1 Выделение в чистую культуру и идентификация
Pseudomonas tumefaciens 20
1.5.2 Идентификация возбудителя корневого рака методом
растений-индикаторов 21
1.5.3 Идентификация возбудителя корневого рака методом
ПЦР-анализа 22
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 24
2.1. Материалы исследования 24
2.2. Методы исследования 25
2.2.1. Подготовка и стерилизация лабораторной посуды 25
2.2.2. Приготовление питательных сред для выделения и
культивирования микроорганизмов 26
2.2.3 Подготовка материала к посеву 27
2.2.4 Выделение возбудителя корневого рака в чистую и
накопительную культуры из опухоли растения 28
2.2.5 Определение характеристик колоний выделенных
микроорганизмов 29
2.2.5.1. Определение цвета колоний выделенных
микроорганизмов 29
2.2.5.2. Определение консистенции колоний и особенностей
роста колоний 29
2.2.5.3 Определение характера роста колоний 30
2.2.5.4 Определение типа дыхания выделенных
микроорганизмов 31
2.2.6 Определение характеристик микроскопического
препарата 31
2.2.6.1 Определение наличия спор 32
2.2.6.2 Окраска по Граму 33
2.2.6.3 Определение размера микробной клетки 34
2.2.6.4Определение подвижности выделенных
микроорганизмов 35
2.2.7 Выявление роста возбудителя на дисках моркови 36
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
3.1. Выделение возбудителя корневого рака в чистую
культуру 38
3.2. Идентификация возбудителя корневого рака на основании
морфологии колоний 39
3.3. Идентификация возбудителя корневого рака на основании
исследования микроскопических препаратов 41
3.4. Тестирование выделенных микроорганизмов на дисках
моркови 45
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 50
ПРИЛОЖЕНИЯ
На сегодняшний день фитопатогенные бактерии являются возбудителями более 200 болезней растений, они вызывают гнили, некрозы, увядания, опухоли, хлорозы и другие поражения растительных культур. С ними связаны большие потери урожая, что наносит неисправимый вред сельскому хозяйству [9].
В настоящее время наблюдается повышение распространенности бактериальных заболеваний в Российской Федерации, одной из причин которого является изменение климата. При увеличении среднесуточной температуры в летний период на 3-4°С распространенность бактериозов повышается в 2 раза, а зараженность растений увеличивается на 30-50% [24].
Все большую опасность для сельского хозяйства представляет корневой бактериальный рак, возбудитель которого распространен в питомниках и поражает в основном плодовые культуры. Иногда он встречается на свекле, моркови, капусте, винограде, помидорах, розах, хризантемах и других культурах [18].
Формирование опухолей у плодовых культур при развитии корневого рака опасно для ряда стран Восточной Европы, в том числе Российской Федерации и стран СНГ, так как в этих странах климат характеризуется резкими температурными перепадами зимой, весной и ранней осенью. Эти климатические условия благоприятно влияют на развитие возбудителя корневого бактериального рака [33]. Кроме того сейчас наблюдается все большее усиление вредоносности корневого рака, что связано с выращиванием растительного посадочного материала по промышленной технологии, которая основывается на использовании вегетативно размножаемых подвоев [35].
Литературный обзор показывает, что заражения растений корневым бактериальным раком встречались в России в разные годы, но вредоносность
6 их проявлялась на отдельных очагах, небольших участках. Наиболее часто они встречались в начале прошлого века, когда не была разработана технология выращивания саженцев с использованием методов защиты от патогенов. Данная проблема характерна и для Центрально - Черноземного региона, где обнаруживались сильные поражения маточника подвоев яблони на площади 2 га [59].
Возбудитель корневого рака вызывает огромные потери урожая. Установлено, что поражение отдельных сортов плодовых культур на Украине достигало 90%. В условиях юга Украины в отдельные годы количество зараженных деревьев черешни и груши с пораженной корневой шейкой составляло 28,6-40%, а с наростами главного корня - 38,5-62,5%.
В Азербайджане заражение виноградных лоз в отдельные годы составляло 3,5-38,4% [41]. В Армении заражение плодовых культур составило 7,7- 33,5%, а в отдельных очагах от 46 % до 89,3% [42-44, 74]. В Молдавии поражение саженцев яблони достигало 58,8%, а косточковых культур 11,2 % [35].
Наибольший ущерб болезнь приносит школам, питомникам и молодым садам при выращивании плодовых деревьев, так как больные растения слабо растут и неустойчивы к стрессовым факторам окружающей среды. Связи с чем выход посадочного материала снижается на 20-40% [58].
На основании вышесказанного нами была поставлена следующая цель: выделить возбудителя корневого бактериального рака из опухолевых образований корня сливы растопыренной (Prunus cerasifera Ehrh.) и идентифицировать его.
Для достижения поставленной в работе цели были сформулированы следующие задачи:
1. выделить возбудителя корневого рака, полученного из опухолевых
образований корня сливы растопыренной (Prunus cerasifera Ehrh.), в чистую культуру;
2. идентифицировать возбудителя корневого рака, основываясь на
характеристиках колоний;
3. идентифицировать возбудителя корневого рака, основываясь на
характеристиках микроскопического препарата;
4. выявить рост возбудителя корневого рака на морковных дисках.
Объектом исследования в работе являются корневой бактериальный рак сливы растопыренной (Prunus cerasifera Ehrh.). Предмет исследования - идентификация возбудителя корневого рака.
Теоретической основой работы послужили исследования отечественных и зарубежных ученных, таких как А.А. Бабаяна, В.П. Израильского,
В.Ф. Пересыпкина, Л.Л. Бунцевича, В.Ф. Бурдинской, М.В. Горленко, Л.Н. Григорцевича, А.Н. Игнатова, Н.Б. Лемановой, М.К. Магера, А.Т. Макрушиной, К.В. Попковой, И.Л. Сербинова,Е.М. Стороженко, Т.М. Фоменко, В.А. Чулкиной, А.А. Ячевского, M.W. Beijerinck, H.J. Conn,M. Detrait, K. Ophel, H. Sawada, E.F. Smith, C.O. Townsend, J.M. Young.
Выпускная квалификационная работа изложена на 60 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы по теме исследования, характеристики объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка используемой литературы и приложений.
В настоящее время наблюдается повышение распространенности бактериальных заболеваний в Российской Федерации, одной из причин которого является изменение климата. При увеличении среднесуточной температуры в летний период на 3-4°С распространенность бактериозов повышается в 2 раза, а зараженность растений увеличивается на 30-50% [24].
Все большую опасность для сельского хозяйства представляет корневой бактериальный рак, возбудитель которого распространен в питомниках и поражает в основном плодовые культуры. Иногда он встречается на свекле, моркови, капусте, винограде, помидорах, розах, хризантемах и других культурах [18].
Формирование опухолей у плодовых культур при развитии корневого рака опасно для ряда стран Восточной Европы, в том числе Российской Федерации и стран СНГ, так как в этих странах климат характеризуется резкими температурными перепадами зимой, весной и ранней осенью. Эти климатические условия благоприятно влияют на развитие возбудителя корневого бактериального рака [33]. Кроме того сейчас наблюдается все большее усиление вредоносности корневого рака, что связано с выращиванием растительного посадочного материала по промышленной технологии, которая основывается на использовании вегетативно размножаемых подвоев [35].
Литературный обзор показывает, что заражения растений корневым бактериальным раком встречались в России в разные годы, но вредоносность
6 их проявлялась на отдельных очагах, небольших участках. Наиболее часто они встречались в начале прошлого века, когда не была разработана технология выращивания саженцев с использованием методов защиты от патогенов. Данная проблема характерна и для Центрально - Черноземного региона, где обнаруживались сильные поражения маточника подвоев яблони на площади 2 га [59].
Возбудитель корневого рака вызывает огромные потери урожая. Установлено, что поражение отдельных сортов плодовых культур на Украине достигало 90%. В условиях юга Украины в отдельные годы количество зараженных деревьев черешни и груши с пораженной корневой шейкой составляло 28,6-40%, а с наростами главного корня - 38,5-62,5%.
В Азербайджане заражение виноградных лоз в отдельные годы составляло 3,5-38,4% [41]. В Армении заражение плодовых культур составило 7,7- 33,5%, а в отдельных очагах от 46 % до 89,3% [42-44, 74]. В Молдавии поражение саженцев яблони достигало 58,8%, а косточковых культур 11,2 % [35].
Наибольший ущерб болезнь приносит школам, питомникам и молодым садам при выращивании плодовых деревьев, так как больные растения слабо растут и неустойчивы к стрессовым факторам окружающей среды. Связи с чем выход посадочного материала снижается на 20-40% [58].
На основании вышесказанного нами была поставлена следующая цель: выделить возбудителя корневого бактериального рака из опухолевых образований корня сливы растопыренной (Prunus cerasifera Ehrh.) и идентифицировать его.
Для достижения поставленной в работе цели были сформулированы следующие задачи:
1. выделить возбудителя корневого рака, полученного из опухолевых
образований корня сливы растопыренной (Prunus cerasifera Ehrh.), в чистую культуру;
2. идентифицировать возбудителя корневого рака, основываясь на
характеристиках колоний;
3. идентифицировать возбудителя корневого рака, основываясь на
характеристиках микроскопического препарата;
4. выявить рост возбудителя корневого рака на морковных дисках.
Объектом исследования в работе являются корневой бактериальный рак сливы растопыренной (Prunus cerasifera Ehrh.). Предмет исследования - идентификация возбудителя корневого рака.
Теоретической основой работы послужили исследования отечественных и зарубежных ученных, таких как А.А. Бабаяна, В.П. Израильского,
В.Ф. Пересыпкина, Л.Л. Бунцевича, В.Ф. Бурдинской, М.В. Горленко, Л.Н. Григорцевича, А.Н. Игнатова, Н.Б. Лемановой, М.К. Магера, А.Т. Макрушиной, К.В. Попковой, И.Л. Сербинова,Е.М. Стороженко, Т.М. Фоменко, В.А. Чулкиной, А.А. Ячевского, M.W. Beijerinck, H.J. Conn,M. Detrait, K. Ophel, H. Sawada, E.F. Smith, C.O. Townsend, J.M. Young.
Выпускная квалификационная работа изложена на 60 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы по теме исследования, характеристики объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка используемой литературы и приложений.
Корневой рак, или зобоватость корней - бактериальное заболевание корней плодовых растений, проявляющееся в виде образования опухолей на корнях и у корневой шейки, заболевание вызывает в России дефицит фруктов собственного производства [30].
Корневой рак распространен во всех зонах выращивания плодовых культур, его высокая вредоносность отмечается не только у нас в стране, но и за рубежом, и несмотря на применение различных мер борьбы отмечается ежегодное прогрессирование возбудителя корневого рака [14]. Из-за поражения корневым раком ежегодно снижается выход посадочного материала на 20-45%. Больные растения становятся неустойчивыми к морозу, слабо растут и со временем погибают.
Возбудитель заболевания - бактерия Pseudomonas tumefaciens, которая индуцирует образование опухолей у широкого круга растений, в большей степени восприимчивыми являются двудольные растения из семейств розоцвеные, толстянковые, пасленовые [15].
Полученные результаты исследования позволяют сделать следующие выводы:
1. В результате исследований был выделен в чистую культуру возбудитель корневого бактериального рака из опухоли корня сливы растопыренной (Prunus cerasifera Ehrh) при высевах на питательные среды МПА и ГМФ;
2. Идентифицирован возбудитель корневого бактериального рака на основании описания колоний, которые имели следующие характеристики: светло-бежевый цвет, непрозрачные с блеском, тягучие, овальной формы, мягкие, легко снимаются с питательной среды, не образуют на ней трещин, образуют поверхностный рост, не растут в анаэробных условиях, строгие аэробы, средний размер колоний - 7,1 ±0,7 мм.
3. Идентифицирован возбудитель корневого бактериального рака
на основании микроскопических препаратов микроорганизмов, которые имели следующие характеристики: палочковидные
бесспоровые бактерии, грамотрицательные, подвижные, ширина клетки - 0,5 ± 0,1 мкм, длина клетки - 1,28 ± 0,12 мкм, что
совпало с литературными данными.
4. идентифицирован возбудитель корневого рака на основании положительно проведенного теста с использованием морковных дисков, на которых через 1 неделю культивирования появлялись опухолевые валики, которые показывают, что микроорганизм является возбудителем корневого рака Pseudomonas tumefaciens.
Таким образом, ходе проведенных исследований были освоены методы выделения, исследования и идентификации патогенных для плодовых саженцев микроорганизмов.
Корневой рак распространен во всех зонах выращивания плодовых культур, его высокая вредоносность отмечается не только у нас в стране, но и за рубежом, и несмотря на применение различных мер борьбы отмечается ежегодное прогрессирование возбудителя корневого рака [14]. Из-за поражения корневым раком ежегодно снижается выход посадочного материала на 20-45%. Больные растения становятся неустойчивыми к морозу, слабо растут и со временем погибают.
Возбудитель заболевания - бактерия Pseudomonas tumefaciens, которая индуцирует образование опухолей у широкого круга растений, в большей степени восприимчивыми являются двудольные растения из семейств розоцвеные, толстянковые, пасленовые [15].
Полученные результаты исследования позволяют сделать следующие выводы:
1. В результате исследований был выделен в чистую культуру возбудитель корневого бактериального рака из опухоли корня сливы растопыренной (Prunus cerasifera Ehrh) при высевах на питательные среды МПА и ГМФ;
2. Идентифицирован возбудитель корневого бактериального рака на основании описания колоний, которые имели следующие характеристики: светло-бежевый цвет, непрозрачные с блеском, тягучие, овальной формы, мягкие, легко снимаются с питательной среды, не образуют на ней трещин, образуют поверхностный рост, не растут в анаэробных условиях, строгие аэробы, средний размер колоний - 7,1 ±0,7 мм.
3. Идентифицирован возбудитель корневого бактериального рака
на основании микроскопических препаратов микроорганизмов, которые имели следующие характеристики: палочковидные
бесспоровые бактерии, грамотрицательные, подвижные, ширина клетки - 0,5 ± 0,1 мкм, длина клетки - 1,28 ± 0,12 мкм, что
совпало с литературными данными.
4. идентифицирован возбудитель корневого рака на основании положительно проведенного теста с использованием морковных дисков, на которых через 1 неделю культивирования появлялись опухолевые валики, которые показывают, что микроорганизм является возбудителем корневого рака Pseudomonas tumefaciens.
Таким образом, ходе проведенных исследований были освоены методы выделения, исследования и идентификации патогенных для плодовых саженцев микроорганизмов.