Помощь студентам в учебе
Некоторые аспекты нерепликативной рекомбинации между фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита
|
Введение 5
2. Обзор литературы 11
2.1 Механизмы генетической рекомбинации РНК-содержащих вирусов 11
2.1.1 Репликативная модель смены матрицы 11
2.1.2 Модель разрыв-лигирование 35
2.1.3 Возможные механизмы нерепликативной рекомбинации 41
2.2 Структура 5 ’-НТО вируса полиомиелита 56
3 Материалы и методы 62
3.1 Ферменты и реактивы 62
3.2 Плазмиды 62
3.3 Бактериальные штаммы 63
3.4 Синтетические олигонуклеотиды 64
3.5 Базовые методы молекулярного клонирования 65
3.6 Направляемый олигонуклеотидами мутагенез 70
3.7 Получение полноразмерных мутантных клонов полиовирусной кДНК. 72
3.8 Создание рабочих конструкций 74
3.9. Получение полноразмерных транскриптов 82
3.10 Трансфекция монослоя культуры клеток. 84
3.11 Анализ вирусных клонов 85
3.12 Модификация 3 ’-концевого нуклеотида РНК 5 ’-фрагмента 89
4. Результаты 93
4.1 Конструирование 5’-и 3 ’-фрагментов геномной РНК вируса полиомиелита ..94
4.2 Неинфекционные фрагменты геномной РНК могут рекомбинировать с образованием инфекционного потомства 101
4.3 Влияние структуры 3’-концевого нуклеотида 5’-фрагмента на эффективность рекомбинации и распределение мест перекреста 105
4.4 Изучение возможного участия криптических рибозимов типа hammerhead в
рекомбинации между фрагментами РНК 109
5.0бсуждение результатов 124
5.1 Рекомбинация между фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита идет по нерепликативному механизму 124
5.2 Механизм нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК. 132
5.2.1 Образование рекомбинантов, содержащих полную последовательность 5’- фрагмента 133
5.2.2 Участие криптических рибозимов типа hammerhead в нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК вируса полиомиелита 138
6. Выводы 141
7. Список литературы 142
2. Обзор литературы 11
2.1 Механизмы генетической рекомбинации РНК-содержащих вирусов 11
2.1.1 Репликативная модель смены матрицы 11
2.1.2 Модель разрыв-лигирование 35
2.1.3 Возможные механизмы нерепликативной рекомбинации 41
2.2 Структура 5 ’-НТО вируса полиомиелита 56
3 Материалы и методы 62
3.1 Ферменты и реактивы 62
3.2 Плазмиды 62
3.3 Бактериальные штаммы 63
3.4 Синтетические олигонуклеотиды 64
3.5 Базовые методы молекулярного клонирования 65
3.6 Направляемый олигонуклеотидами мутагенез 70
3.7 Получение полноразмерных мутантных клонов полиовирусной кДНК. 72
3.8 Создание рабочих конструкций 74
3.9. Получение полноразмерных транскриптов 82
3.10 Трансфекция монослоя культуры клеток. 84
3.11 Анализ вирусных клонов 85
3.12 Модификация 3 ’-концевого нуклеотида РНК 5 ’-фрагмента 89
4. Результаты 93
4.1 Конструирование 5’-и 3 ’-фрагментов геномной РНК вируса полиомиелита ..94
4.2 Неинфекционные фрагменты геномной РНК могут рекомбинировать с образованием инфекционного потомства 101
4.3 Влияние структуры 3’-концевого нуклеотида 5’-фрагмента на эффективность рекомбинации и распределение мест перекреста 105
4.4 Изучение возможного участия криптических рибозимов типа hammerhead в
рекомбинации между фрагментами РНК 109
5.0бсуждение результатов 124
5.1 Рекомбинация между фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита идет по нерепликативному механизму 124
5.2 Механизм нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК. 132
5.2.1 Образование рекомбинантов, содержащих полную последовательность 5’- фрагмента 133
5.2.2 Участие криптических рибозимов типа hammerhead в нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК вируса полиомиелита 138
6. Выводы 141
7. Список литературы 142
РНК-рекомбинация - процесс образования новых (дочерних) последовательностей РНК из двух или нескольких предшествующих (родительских) молекул РНК. Под такое определение рекомбинации попадают известные различные перестройки РНК-геномов, такие как вставки, делеции, образование химерных молекул РНК.
Первые данные в пользу генетической рекомбинации между двумя несегментированными РНК-геномами были получены на примере вируса полиомиелита (Ledinko et al., 1963). Смешанная инфекция двумя штаммами полиовируса, несущими разные фенотипические маркеры (такие, как устойчивость к небольшим концентрациям гуанидина. НС1 или ингибиторам, присутствующим в некоторых пулах лошадиной или бычьей сыворотки), приводила к появлению вариантов вируса, содержащих оба фенотипических маркера. Так как частота появления вируса с «двойным» фенотипом была выше, чем частота спонтанных мутаций, было предположено, что образовавшийся вирус является продуктом рекомбинации между молекулами РНК исходных вирусов. Используя тот же подход, было показано, что вирус ящура также способен рекомбинировать с образованием вирусов с «двойным» фенотипом (Pringle, 1965).
P. D. Cooper с соавторами, используя набор температурочувствительных мутантов полиовируса, определял частоту рекомбинации между разными парами маркеров. Обнаруженные частоты рекомбинации позволили построить карты сцепления данных маркеров, где расстояние между маркерами было пропорционально частоте рекомбинации между ними (Cooper, 1968). Полученные частоты рекомбинации были аддитивны по отношению к любой
паре маркеров и позволяли расположить их линейно по геному. Несколько позднее подобные карты были получены для вируса ящура (Lake et al., 1975; McCahon et al., 1977). Возможность построения таких карт является сильным аргументом в пользу рекомбинации между РНК-геномами (Lai, 1992). Дальнейшие исследования показали (McCahon et al., 1885; Kirkergaard and Baltimore, 1986; Agut et al., 1987; King 1988a), что места перекреста у рекомбинантов принципиально могут располагаться на любом участке вирусного генома (см. также обзоры King, 1988b; Lai, 1992; Agol, 1997).
Первые биохимические доказательства в пользу РНК-рекомбинации были получены в результате анализа структурных и неструктурных белков рекомбинантных вирусов полиомиелита (Romanova et al., 1980; Tolskaya et al., 1983) и вируса ящура (King et al., 1982).
Определение первичной структуры мест перекреста рекомбинантных вирусов окончательно доказало, что их последовательности произошли от разных молекул РНК (Romanova et al., 1986; Kirkegaard and Baltimore, 1986).
Вторым семейством РНК-содержащих вирусов, на представителях которого была доказана возможность рекомбинации между РНК геномами, являются коронавирусы (см. обзор Lai, 1992). При смешанной инфекции двумя различными штаммами (А59 и JHM) вируса мышиного гепатита (MHV), содержащих в качестве фенотипических маркеров температурочувствительные мутации, при непермиссивной температуре было получено инфекционное потомство (Lai, 1985). Полученный вирус был представлен рекомбинантной РНК, содержащей 5'-концевой участок (приблизительно 3000 нт) от геномной РНК JHM, тогда как остальная часть вирусного генома соответствовала штаму
% В дальнейшем рекомбинанты у коронавирусов были получены при
использовании в качестве фенотипических маркеров
температурочувствительных мутаций (Keck et al., 1987, 1988; Makino et al.,
1986) , способность вызывать слияние клеток, устойчивость к нейтрализующему действию моноклональных антител (Makino et al., 1987). Характерной особенностью рекомбинации коронавирусов является наличие множественных мест перекреста. Места перекреста располагались не только на участке между селективными маркерами, но и за его пределами (Makino et al., 1987; Keck et al., 1988). Так как эти случаи рекомбинации не требовали какого-либо селективного давления, то подобная структура рекомбинантов говорит о высоком рекомбинационном потенциале геномной РНК коронавирусов (Lai, 1992). И хотя первые данные свидетельствовали, что места перекреста концентрируются
Я, в 5’-концевой области генома (Lai et al., 1985; Makino et al.,1986; Keck et al.,
1987) , в последующих работах были описаны рекомбинанты, места перекреста которых были распределены по всему геному соответствующих вирусов (Makino et al., 1987; Keck et al., 1988).
Полученные частоты рекомбинации при скрещивании вирусов мышиного гепатита [А59], содержащих различные температурочувствительных мутации, так же позволили построить линейную аддитивную карту сцепления данных фенотипических маркеров на 5’-участке генома длинной 23000 нуклеотидов. (Baric et al., 1990).
Впервые РНК-рекомбинация у вирусов растений была продемонстрирована у представителей семейств: бромовирусов (вирус мозаики костра; Bujarski and Kaesberg, 1986), кармовирусов (вирус скрученности турнепса; Cascone et al., 1990). Первые данные по РНК-рекомбинации у
7
бактериофагов были получены на примере фага QP (Munishkin et al., 1988).
За последнее время РНК-рекомбинация была описана для многих РНК- содержащих вирусов животных, растений и бактерий (см. обзоры Lai, 1992; Agol, 1997; Nagy and Simon, 1997; Aaziz and Tepfler, 1999). При этом частота рекомбинации у некоторых вирусов (пикорна - и коронавирусов) сравнима с частотой ДНК-рекомбинации (King 1988b; Lai, 1992). Таким образом, становиться ясно, что РНК-рекомбинация у РНК-содержащих вирусов выполняет определенные общебиологические функции. Во-первых, она может выполнять репаративную функцию. Как известно, ни одна из РНК-зависимых РНК-полимераз и обратных транскриптаз не обладают корректирующей активностью, что обуславливает относительно высокий уровень частоты спонтанных мутаций при репликации геномной РНК (см. обзоры Lai, 1992; Domingo et al., 1996; Domingo and Holland, 1997). Частота ошибочного встраивания у различных РНК-полимераз от 10'3 до 10'5 говорит о том, что каждая реплицированная молекула РНК будет содержать 0.1-10 мутаций (если геномная РНК вируса состоит из 10000 нуклеотидов) (Domingo and Holland, 1997; Sierra et al., 2000; Crotty et al., 2001). Следовательно, вирусы должны иметь в распоряжении определенные механизмы, которые могут устранять спонтанные мутации или компенсировать их негативное фенотипическое проявление. РНК-рекомбинация может быть таким механизмом, который за счет замены участков генома на гомологичные последовательности устраняет функционально значимые ошибки (King 1988b; Lai, 1992; Nagy and Simon, 1997).
Первые данные в пользу генетической рекомбинации между двумя несегментированными РНК-геномами были получены на примере вируса полиомиелита (Ledinko et al., 1963). Смешанная инфекция двумя штаммами полиовируса, несущими разные фенотипические маркеры (такие, как устойчивость к небольшим концентрациям гуанидина. НС1 или ингибиторам, присутствующим в некоторых пулах лошадиной или бычьей сыворотки), приводила к появлению вариантов вируса, содержащих оба фенотипических маркера. Так как частота появления вируса с «двойным» фенотипом была выше, чем частота спонтанных мутаций, было предположено, что образовавшийся вирус является продуктом рекомбинации между молекулами РНК исходных вирусов. Используя тот же подход, было показано, что вирус ящура также способен рекомбинировать с образованием вирусов с «двойным» фенотипом (Pringle, 1965).
P. D. Cooper с соавторами, используя набор температурочувствительных мутантов полиовируса, определял частоту рекомбинации между разными парами маркеров. Обнаруженные частоты рекомбинации позволили построить карты сцепления данных маркеров, где расстояние между маркерами было пропорционально частоте рекомбинации между ними (Cooper, 1968). Полученные частоты рекомбинации были аддитивны по отношению к любой
паре маркеров и позволяли расположить их линейно по геному. Несколько позднее подобные карты были получены для вируса ящура (Lake et al., 1975; McCahon et al., 1977). Возможность построения таких карт является сильным аргументом в пользу рекомбинации между РНК-геномами (Lai, 1992). Дальнейшие исследования показали (McCahon et al., 1885; Kirkergaard and Baltimore, 1986; Agut et al., 1987; King 1988a), что места перекреста у рекомбинантов принципиально могут располагаться на любом участке вирусного генома (см. также обзоры King, 1988b; Lai, 1992; Agol, 1997).
Первые биохимические доказательства в пользу РНК-рекомбинации были получены в результате анализа структурных и неструктурных белков рекомбинантных вирусов полиомиелита (Romanova et al., 1980; Tolskaya et al., 1983) и вируса ящура (King et al., 1982).
Определение первичной структуры мест перекреста рекомбинантных вирусов окончательно доказало, что их последовательности произошли от разных молекул РНК (Romanova et al., 1986; Kirkegaard and Baltimore, 1986).
Вторым семейством РНК-содержащих вирусов, на представителях которого была доказана возможность рекомбинации между РНК геномами, являются коронавирусы (см. обзор Lai, 1992). При смешанной инфекции двумя различными штаммами (А59 и JHM) вируса мышиного гепатита (MHV), содержащих в качестве фенотипических маркеров температурочувствительные мутации, при непермиссивной температуре было получено инфекционное потомство (Lai, 1985). Полученный вирус был представлен рекомбинантной РНК, содержащей 5'-концевой участок (приблизительно 3000 нт) от геномной РНК JHM, тогда как остальная часть вирусного генома соответствовала штаму
% В дальнейшем рекомбинанты у коронавирусов были получены при
использовании в качестве фенотипических маркеров
температурочувствительных мутаций (Keck et al., 1987, 1988; Makino et al.,
1986) , способность вызывать слияние клеток, устойчивость к нейтрализующему действию моноклональных антител (Makino et al., 1987). Характерной особенностью рекомбинации коронавирусов является наличие множественных мест перекреста. Места перекреста располагались не только на участке между селективными маркерами, но и за его пределами (Makino et al., 1987; Keck et al., 1988). Так как эти случаи рекомбинации не требовали какого-либо селективного давления, то подобная структура рекомбинантов говорит о высоком рекомбинационном потенциале геномной РНК коронавирусов (Lai, 1992). И хотя первые данные свидетельствовали, что места перекреста концентрируются
Я, в 5’-концевой области генома (Lai et al., 1985; Makino et al.,1986; Keck et al.,
1987) , в последующих работах были описаны рекомбинанты, места перекреста которых были распределены по всему геному соответствующих вирусов (Makino et al., 1987; Keck et al., 1988).
Полученные частоты рекомбинации при скрещивании вирусов мышиного гепатита [А59], содержащих различные температурочувствительных мутации, так же позволили построить линейную аддитивную карту сцепления данных фенотипических маркеров на 5’-участке генома длинной 23000 нуклеотидов. (Baric et al., 1990).
Впервые РНК-рекомбинация у вирусов растений была продемонстрирована у представителей семейств: бромовирусов (вирус мозаики костра; Bujarski and Kaesberg, 1986), кармовирусов (вирус скрученности турнепса; Cascone et al., 1990). Первые данные по РНК-рекомбинации у
7
бактериофагов были получены на примере фага QP (Munishkin et al., 1988).
За последнее время РНК-рекомбинация была описана для многих РНК- содержащих вирусов животных, растений и бактерий (см. обзоры Lai, 1992; Agol, 1997; Nagy and Simon, 1997; Aaziz and Tepfler, 1999). При этом частота рекомбинации у некоторых вирусов (пикорна - и коронавирусов) сравнима с частотой ДНК-рекомбинации (King 1988b; Lai, 1992). Таким образом, становиться ясно, что РНК-рекомбинация у РНК-содержащих вирусов выполняет определенные общебиологические функции. Во-первых, она может выполнять репаративную функцию. Как известно, ни одна из РНК-зависимых РНК-полимераз и обратных транскриптаз не обладают корректирующей активностью, что обуславливает относительно высокий уровень частоты спонтанных мутаций при репликации геномной РНК (см. обзоры Lai, 1992; Domingo et al., 1996; Domingo and Holland, 1997). Частота ошибочного встраивания у различных РНК-полимераз от 10'3 до 10'5 говорит о том, что каждая реплицированная молекула РНК будет содержать 0.1-10 мутаций (если геномная РНК вируса состоит из 10000 нуклеотидов) (Domingo and Holland, 1997; Sierra et al., 2000; Crotty et al., 2001). Следовательно, вирусы должны иметь в распоряжении определенные механизмы, которые могут устранять спонтанные мутации или компенсировать их негативное фенотипическое проявление. РНК-рекомбинация может быть таким механизмом, который за счет замены участков генома на гомологичные последовательности устраняет функционально значимые ошибки (King 1988b; Lai, 1992; Nagy and Simon, 1997).
1. Показана возможность образования инфекционной РНК путем нерепликативной рекомбинации между взаимодополняющими 5’- и 3’- фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита, которые не способны самостоятельно транслироваться и реплицироваться.
2. Выявлено два класса рекомбинантов: (1) рекомбинанты, содержащие в своем составе полную последовательность 5’-фрагмента; (2) рекомбинанты, места перекреста у которых располагаются на внутренних участках обоих фрагментов.
3. Для эффективного образования рекомбинантов первого класса требуется наличие З’-концевого монофосфата у 5’-фрагмента. Предложена гипотетическая модель образования таких рекомбинантов.
4. Места перекреста рекомбинантов второго класса на 3’- и 5’- фрагментах располагаются неравномерно, формируя “горячие точки”. Получены указания на возможное участие криптической рибозимной активности полиовирусной РНК в образовании одной из этих «горячих точек». Однако вопрос о том, какой количественный вклад в рекомбинацию вносит криптический рибозим, требует дополнительных исследований.
141
2. Выявлено два класса рекомбинантов: (1) рекомбинанты, содержащие в своем составе полную последовательность 5’-фрагмента; (2) рекомбинанты, места перекреста у которых располагаются на внутренних участках обоих фрагментов.
3. Для эффективного образования рекомбинантов первого класса требуется наличие З’-концевого монофосфата у 5’-фрагмента. Предложена гипотетическая модель образования таких рекомбинантов.
4. Места перекреста рекомбинантов второго класса на 3’- и 5’- фрагментах располагаются неравномерно, формируя “горячие точки”. Получены указания на возможное участие криптической рибозимной активности полиовирусной РНК в образовании одной из этих «горячих точек». Однако вопрос о том, какой количественный вклад в рекомбинацию вносит криптический рибозим, требует дополнительных исследований.
141