Список сокращений 4
Введение 5
1. Обзор литературы 7
1.1 Роль липидных рафтов в миграции клеток 7
1.2 Структура липидных рафтов 9
1.2.1 Основные компоненты и функции липидных рафтов 10
1.2.2 Модели липидных рафтов 11
1.2.3 Значимость липидных рафтов 13
1.2.4 Разрушение липидных рафтов с помощью 14
метил-бета-циклодекстрина (МбЦД) 14
1.3 Что такое метил-бета-циклодекстрин? 16
1.3.1 МбЦД используется для удаления холестерина из клеточных мембран 17
1.3.2 Влияние МбЦД на распределение холестерина между различными клеточными
мембранами 17
1.3.3 Извлечение холестерина из липидных рафтов 18
2. Материалы и методы 20
2.1 Клеточные культуры 20
2.2. Измерение подвижности клеток методом зарастания экспериментальной раны 20
2.3. Определение скорости клеточного движения методом измерения миграции одиночных
клеток 21
2.4. Микроскопия 21
2.5. Обработка изображений 22
2.6. Статистическая обработка данных 23
3. Результаты и обсуждение 24
3.1. Проверка автоматического метода работы программного обеспечения TScratch для измерения площади зарастания экспериментальной раны 24
3.2 Измерение подвижности клеток методом зарастания экспериментальной раны 25
3.3 Определение скорости клеточного движения методом измерения миграции одиночных клеток 28
4. Выводы 30
5. Список литературы 31
Миграция клеток на субстрате представляет собой сумму нескольких временных и пространственно-координированных процессов, которые включают в себя формирование псевдоподий на лидирующем активном крае, адгезию лидирующего края к субстрату, перемещение тела клетки и разборку адгезий (контактов) в хвостовой части клетки. Актиновый цитоскелет лежит в основе клеточного передвижения, его реорганизация обеспечивает движущую силу для продвижения вперед мембраны на лидирующем крае и тянущую силу для перемещения тела клетки (Wang et al., 2013). Формирование фокальных контактов на переднем крае клетки и их разборка на хвостовом участке также необходимы для перемещения клеток (Webb et al., 2002; Webb et al., 2004; Broussard, 2008). Факторы, влияющие на реорганизацию актинового цитоскелета, являются потенциальными регуляторами динамики фокальных контактов (Wang et al., 2013). Одними из таких вероятных факторов являются липидные рафты.
Липидные рафты являются особыми мембранными микродоменами, которые состоят из холестерина, сфинголипидов, включая сфингомиелин и ганглиозиды, а также некоторых типов белков. В структуру липидных рафтов входит Src-семейство киназ, регулирующих работу киназ фокальных адгезий (FAK). FAK влияют на миграцию клеток, регулируя активность малых ГТФаз Rho, белков, активирующих ГТФазу, фактор обмена гуанинового нуклеотида (GEF) (Schlaepfer et al, 2004; Mitra et al., 2005). Липидные рафты регулируют разборку фокальных контактов и играют важную роль при миграции опухолевых клеток, подчеркивая потенциал агентов, воздействующих на рафты, в качестве эффективных противораковых лекарственных средств. Одним из агентов, вызывающим разрушение липидных рафтов вследствие частичного извлечения мембранного холестерина, является метил-бета-циклодекстрин (МбЦД) (Wang et al., 2013).
МбЦД представляет собой циклический олигосахарид, состоящий из а-(1-4) - связанных звеньев D-глюкопиранозы, которые являются продуктами первичной деградации крахмала (Davis, Brewster, 2004; Uekama, 2004). Это соединение давно признано в качестве мощного носителя гидрофобных лекарственных средств, поскольку оно, хотя и растворимо в воде, содержит гидрофобную полость, которая может инкапсулировать различные гидрофобные молекулы. Относительно высокие (>10 мМ) концентрации МбЦД и относительно длительные (> 30 мин) воздействия приводят к истощению холестерина из всех мембранных фракций. Однако холестерин из липидных рафтов под действием циклодекстринов удаляется более эффективно, чем из других мембранных фракций (Gaus et al., 2004; Rouquette-Jazdanian et al., 2006).
Данные литературы свидетельствуют о том, что воздействие МбЦД на клетки меланомы человека (линия А375) вызывает увеличение числа фокальных контактов, стресс-фибрилл, и снижение скорости миграции (Wang et al., 2013). Обработка клеток эмбриональных фибробластов мыши (линия 3T3B-SV40) МбЦД также приводит к интенсивному формированию стресс-фибрилл (Чубинский-Надеждин, 2012). В то же время, роль МбЦД в подвижности клеток данной клеточной линии не изучена.
Целью данной работы было изучение влияния метил-бета- циклодекстрина на клеточную миграцию трансформированных эмбриональных фибробластов мыши (линия 3T3B-SV40).
Для выполнения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Проверить автоматический метод работы программного обеспечения TScratch для измерения площади зарастания экспериментальной раны.
2. Измерить подвижность клеток методом зарастания экспериментальной раны.
3. Определить скорость клеточного движения методом измерения миграции одиночных клеток.
1. Была проведена проверка работы автоматического метода программы TScratch. Данный метод позволяет определять площадь зарастания экспериментальной раны с небольшой погрешность измерения.
2. Частичная экстракция мембранного холестерина при воздействии 5 мМ МбЦД на клетки линии 3T3B-SV40 приводит к уменьшению скорости зарастания экспериментальной раны.
3. Клетки демонстрируют снижение скорости движения в эксперименте по миграции одиночных клеток вследствие воздействия на них 5 мМ МбЦД.
4. Результаты оценки скорости клеточного движения, полученные на моделях зарастания экспериментальной раны и при исследовании подвижности одиночных клеток подтверждают, что разрушение липидных рафтов при действии 5 мМ МбЦД снижает скорость клеточной миграции клеток 3Т3B-SV40.
