Введение 3
1. Состояние проблемы охраны генофондов редких видов растений
1.1. Характеристика генофондов редких и исчезающих видов растений.. .5
1.2. Проблемы молекулярно-генетической идентификации и паспортизации
растений 6
1.3. Виды сохранения редких и исчезающих видов растений 9
2. Специфика выделения ДНК из растительных объектов
2.1. Особенности выделения ДНК из растительных объектов 15
2.2. Выделение ДНК из обезвоженных (дегидрированных тканей)
растений 20
3. Создание банка ДНК редких видов эндемичных растений
3.1. Характеристика региона исследования 23
3.2. Материалы и методы 25
3.3. Анализ генетического разнообразия популяций 32
3.4. Анализ генетической изменчивости 36
4. Экспериментальная часть 38
5. Выводы 49
Список литературы 51
Сохранение и воспроизводство ресурсов - одна из наиболее актуальных проблем XXI века.
Многие виды растений, грибов и животных стали редкими: состоят из нескольких малочисленных популяций, распространённых на ограниченной территории. Некоторые виды находятся под угрозой исчезновения, их численность сократилась до критического уровня — это исчезающие виды. Если факторы, вызвавшие сокращение численности, будут продолжать действовать, то сохранение таких видов маловероятно.
Собирая букеты первоцветов, разных видов гвоздик и колокольчиков, мы лишаем эти растения возможности дать плоды и семена. Заготавливая лекарственные растения (зверобой, душицу, валериану), сборщики часто вырывают их с корнями, а не срезают часть побега. После таких хищнических заготовок популяции растений могут не возобновиться.
Редкие и исчезающие виды нуждаются в охране, и их заносят в Красные книги. Включение вида в Красную книгу — сигнал о необходимости принятия срочных мер по его спасению.
Каждая страна, на территории которой обитает вид, включённый в Красную книгу, несёт ответственность перед всем человечеством за его сохранение.
Несмотря на принимаемые меры в настоящее время не представляется возможным сохранить отдельные исчезающие виды, поэтому предпринимаются попытки сохранить их гены.
Банк геномов создаётся путём хранения наследственной информации животных и растений в целости методом замораживания их семян, спор, половых и соматических клеток, а также тканей животных. Для этой цели используются методы их консервации — временного приостановления некоторых процессов. Самым эффективным среди них является метод замораживания — криоконсервации (замораживания при очень низкой температуре).
Банк генов (введение в бактериальную клетку). В результате развития генетической инженерии появилась возможность выделения отдельных ценных генов исчезающих животных и растений, введения их в бактериальную клетку и создания таким путём банка генов.
Наследственную информацию, сохраняемую в настоящее время в законсервированном виде или в виде банка генов, можно впоследствии размножить (клонировать) и использовать для восстановления этих видов.
Исследования на уровне ДНК, помимо собственно молекулярной биологии, стали уже рутинной практикой в селекции, таксономии, оценке и сохранении биоразнообразия, эволюции, изучении генетических основ регуляции физиологических процессов и устойчивости к биотическим и абиотическим факторам среды, биотехнологии, биоинженерии и др. Достигнутый современный уровень молекулярно-генетических подходов: генотипирование, секвенирование позволяет анализировать огромное количество растительных организмов с целью выявления полиморфизма, молекулярных основ фенотипической изменчивости и устойчивости к стрессовым факторам среды и др.
Это мотивирует международное сотрудничество в области оценки и систематизации мировых генетических ресурсов, в том числе важнейших сельскохозяйственных культур и их диких сородичей.
Мировое ботаническое сообщество одной и важнейших задач настоящего времени определяет создание глобальной карты мирового биоразнообразия. Это стало возможным, в том числе, на основе современных биохимических и молекулярно-генетических подходов с использованием различных классов молекулярных маркеров. Одним из перспективных средств для описания биоразнообразия является ДНК-баркодирование с использованием определенных последовательностей как ядерной, так и в особенности митохондриальной и хлоропластной ДНК.
В последнее десятилетие молекулярные данные, полученные на основе ДНК, позволяют более точно охарактеризовать систематические взаимоотношения между высшими растениями. Зачастую молекулярные данные подтверждают гипотезы, основанные на морфологии и др., в ряде случаев эти данные предлагают новый взгляд на систематику и биогеографию. Филогенетические исследования играют важную роль в понимании истории развития популяций, одомашнивания и создания культурных видов растений. В сочетании с археоботаническими и археологическими исследованиями они проясняют картину эволюции диких и культурных видов растений.
По сути, современная систематика и биогеография объединяются в изучении вопросов распространения растений под влиянием исторических и экологических факторов.
Во многих случаях молекулярные исследования растений требуют экстракции геномной ДНК высокого качества и в больших количествах. Однако исследуемые растения могут обладать различными видовыми физическими и биохимическими особенностями, препятствующими этому.
Совершенно очевидно, что для разных групп растений оказываются эффективными разные методики выделения ДНК. При необходимости получить большое количество высококачественной ДНК необходимо учитывать вид растений. Взяли на вооружение метод выделения ДНК, основанный на использовании частичек парамагнитной целлюлозы MagnaCel от компании Promega (РМС). Технология изначально была разработана и используется в судебной экспертизе, где чаще всего имеют дело с мизерным количеством генетического материала. Авторы исследования оценили применимость данной технологии к выделению растительной ДНК и сделали сравнение с двумя наиболее популярными методами - с использованием колонок DNeasy Plant Mini Kit и цетилтриметиламмониумбромида (СТАВ). Был проанализирован широкий спектр видов цветущих растений - 3 видов растений По количеству выделенной ДНК новый метод РМС показал результат, в два раза превосходящий другие методы, более того, в отличие от СТАВ метода, в нем не используются опасные химические вещества.
Статистический анализ также показал достоверность существенных различий по качеству и количеству полученной ДНК как между тремя методами, так и между различными таксономическими группами растений. Таким образом, авторы публикации заявили об очевидном преимуществе нового метода в случаях, когда, в силу особенностей исследуемого растения, затруднительно получение достаточных количеств чистой
высокомолекулярной ДНК.
