📄Работа №67213

Тема: Характеристика свойств метанолдегидрогеназы из бесклеточного экстракта метилобактерий M. extorquens pCM160

📝
Тип работы Бакалаврская работа
📚
Предмет химия
📄
Объем: 63 листов
📅
Год: 2020
👁️
Просмотров: 92
3900 руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
ℹ️ Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание 📖 Введение ✅ Заключение 📕 Литература 🖼 Скриншоты 🔍 Похожие 🛒 Купить

📋 Содержание

Введение 4
2. Литературный обзор 6
2.1.Общая характеристика метилотрофных бактерий 6
2.2. Структура фермента МДГ и механизм его взаимодействия с
субстратом метанолом 8
2.3. Рост M.extorquens pCM160 на многоуглеродистых субстратах 13
2.4. Кинетика ферментативных реакций 15
2.5. Активность ферментов и методы ее определения 21
2.6. Методы определения активности ферментов: 21
2.6.1. Методы определения активности дегидрогеназ 23
2.7. Характеристики фермента 25
2.8.Заключение 30
3.Экспериментальная часть 31
3.1.Объект исследования 31
3.2. Культивирование метилотрофных бактерий 31
3.3.Определение активности фермента 32
3.4. Количественное определение белка по методу Лоури 33
4.Обсуждение результатов 35
4.1. Культивирование биомассы метилобактерий M.extorquens pCM160 35
4.2. Количественное определение содержания белка 35
4.2.1.Определение активности фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 36
4.3. Характеристики фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 38
4.3.1. Активация фермента МДГ 38
4.3.2.Определение субстратной специфичности фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 41
1. Введение 4
2. Литературный обзор 6
2.1.Общая характеристика метилотрофных бактерий 6
2.2. Структура фермента МДГ и механизм его взаимодействия с
субстратом метанолом 8
2.3. Рост M.extorquens pCM160 на многоуглеродистых субстратах 13
2.4. Кинетика ферментативных реакций 15
2.5. Активность ферментов и методы ее определения 21
2.6. Методы определения активности ферментов: 21
2.6.1. Методы определения активности дегидрогеназ 23
2.7. Характеристики фермента 25
2.8.Заключение 30
3.Экспериментальная часть 31
3.1.Объект исследования 31
3.2. Культивирование метилотрофных бактерий 31
3.3.Определение активности фермента 32
3.4. Количественное определение белка по методу Лоури 33
4.Обсуждение результатов 35
4.1. Культивирование биомассы метилобактерий M.extorquens pCM160 35
4.2. Количественное определение содержания белка 35
4.2.1.Определение активности фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 36
4.3. Характеристики фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 38
4.3.1. Активация фермента МДГ 38
4.3.2.Определение субстратной специфичности фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 41
4.3.3.Определение кинетических параметров фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам 44
4.3.4. Влияние солей металлов на активность фермента МДГ в
бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 46
4.3.5. Стабильность фермента в бесклеточном экстракте M.extorquens
pCM160 при различных условиях хранения 48
4.3.6. рН стабильность фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 50
4.4. Суммарная таблица по рассмотренным характеристикам 53
Выводы 54
Список использованной литературы 55
Приложения 60

📖 Введение

Микроорганизмы представляют особый интерес в современной биотехнологии, так как способны использовать метан и метанол для синтеза полезных продуктов, таких как кормовой белок, пигменты, препараты гомологичных ферментов, рекомбинантные белки, компоненты электронно-транспортной цепи, витамины, коферменты, аминокислоты [1]. Такими микроорганизмами являются метилотрофы, способные использовать окисленные и восстановленные соединения C 1, такие как метан, метанол, метиламин и другие, в качестве единственного источника углерода и энергии [2]. Род Methylobacterium является одним из наиболее распространенных и играет важную роль в научных исследованиях, в частности, для мониторинга уровня токсичных соединений С1 и их последующей биоремедиации [3].
Клетки этих бактерий характеризуются высокой концентрацией периплазматических дегидрогеназ, основной из которых является метанолдегидрогеназа (МДГ) - фермент, катализирующий окисление метанола до формальдегида, а также способный окислять первичные спирты и альдегиды, используя искусственные акцепторы электронов.
В этом году было обнаружено, что многие бактерии, содержащие фермент МДГ, используют в своих активных центрах лантаноиды. Это открытие привело к появлению совершенно новой области исследований - лантаноид-зависимого бактериального метаболизма и биохимии [42]. Поэтому для получения воспроизводимых результатов в данной области исследования, необходим правильный подбор характеристических свойств МДГ. К таким показателям относятся кинетические характеристики фермента, субстратная специфичность МДГ к тому или иному субстрату, определенный диапазон pH, условия хранения биомассы, влияние посторонних примесей в виде солей тяжелых металлов, то есть это условия, при несоблюдении которых может снизится активность фермента.
В связи с этим, целью работы является характеристика свойств фермента МДГ в бесклеточном экстракте Methylobacterium extorquens pCM160.
Для выполнения поставленной цели поставлены следующие задачи:
4
1) Нарастить биомассу бактерий Methylobacterium extorquens pCM160 и получить бесклеточный экстракт для дальнейших исследований;
2) Определить субстратную специфичность и кинетические параметры, такие как константу Михаэлиса, максимальную скорость для фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам;
3) Определить влияние солей металлов на активность фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160;
4) Определить стабильность при хранении и рН-стабильность фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160.
5)

Возникли сложности?

Нужна качественная помощь преподавателя?

👨‍🎓 Помощь в написании
🎓 Дипломные 📘 Магистерские 📙 Диссертации 📗 Курсовые 📝 Статьи 📄 ВКР

✅ Заключение

1. Нарастили биомассу бактерий Methylobacterium extorquens pCM160 и получили бесклеточный экстракт M.extorquens pCM160, объем которого составил 7,1 мл, исходная концентрация белка 11,04 мг/мл, суммарный белок 78,4 мг;
2. Определили субстратную специфичность фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM16 от концентрации различных субстратов, в результате чего, самый большой ответ приходятся на метанол (максимальная активность 1,362 Ед/мл и удельная активность 0,123 Ед/мг белка);
3. Наибольшее сродство фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM16 к метанолу КМ = 0,4±0,2 мМ. Максимальные скорости реакции окисления спиртов и альдегидов под действием МДГ для четырех субстратов приблизительно равны: метанол 0,1±0,003 Ед/мг белка, изопропанол 0,1±0,006 Ед/мг белка, трет-бутанол 0,09±0,004 Ед/мг белка, муравьиная кислота 0,093±0,002 Ед/мг белка;
4. При проверке влияния ионов металлов на удельную активность фермента МДГ получились следующие результаты: при добавлении ионов металлов Ga2+- Ba2+, Sr2+ наблюдается увеличение активности МДГ в бесклеточном экстракте на 8-14%; при добавлении ионов металлов Pb2+, Zn2+, Mg2+ и Mn2+ наблюдается незначительное снижение активности на 7¬10%; при добавлении солей тяжелых металлов (Со2+) происходит сильное ингибирование на 55% и полное подавление активности раствором соли Gu2+.
5. Определили стабильность фермента в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 при +4oC и -20oC , получили следующие результаты: при +4oC активность фермента снижается на 85% на седьмые сутки, а потом полностью отсутствует после седьмых суток; при -20oC за 60 суток активность уменьшается на 31%.
6. Определили рН стабильность фермента в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 , максимальная активность которого наблюдается в диапазоне pH 7-11.
7.

Нужна своя уникальная работа?
Срочная разработка под ваши требования
Рассчитать стоимость
ИЛИ
Поиск аналога

📕 Список литературы

1. Ю. А. Троценко. Аэробные метилотрофы - перспективные объекты современной биотехнологии // Журнал Сибирского федерального университета. Биология. 2012. Т. 5. № 3. С. 243-279.
2. Nakagawa T., Mitsui R., Tani A., Sasa K., Tashiro S., Iwama T., Hayakawa T., Kawai K. A catalytic role of XoxF1 as La3+-dependent methanol dehydrogenase in Methylobacterium extorquens strain AM1 // PLoS ONE. 2012. V. 7. № 11;
3. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs // New York, NY: Academic Press - 1982.
4. Цыганков Ю.Д. Физиологическая характеристика метилотрофных бактерий. Биология термофильных микроорганизмов // Ю.Д. Цыганков. - Москва: Наука. 1986. C. 31- 50.
5. Lidstrom M.E. Aerobic methylotrophic prokaryotes // New York: Springer-Verlag. 2006. Chapter 1.20.P. 618-634.
6. Elizabeth Skovran; Gregory J. Crowther; Xiaofeng Guo; Song Yang; Mary E. Lidstrom. A Systems Biology Approach Uncovers Cellular Strategies Used by Methylobacterium extorquens AM1 During the Switch from Multi- to Single-Carbon Growth // PLoS ONE. 2012. № 5.
7. A.Y.Chistoserdov, L.V.Chistoserdova, W.S.McIntire, M.E.Lidstrom. Genetic organization of the mau gene cluster in Methylobacterium extorquens AM1: complete nucleotide sequence and generation and characteristics of mau mutants // J Bacteriol. 1994. V. 176. P. 4052 - 4065.
8. Delmotte N., Knief S., Chaffron G., Innerebne, B., Roschitzki R., Schlapba, C., von Mering, and J. A. Vorholt. Community proteogenomics reveals insights into the physiology of phyllosphere bacteria // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009. V. 106. P. 16428-16433.
9. Corpe Washington. Method for detecting methylotrophic bacteria on solid surfaces // J. Microbiol. 1985. V.3. P. 215-221.
10. W.A.Corpe, S.Rheem. Ecology of methylotrophic bacteria on the surface of living leaves // FEMS Microbiol Ecol. 1989. V. 62. P.243-250.
11. Kneff S., Delmontt Н., Saffron S., Stark М., Innebner G.,Wassman Р., von Mering S., Worholt I.A // ISME. 2012. V.6. P. 1378-1390.
12. Abanda-Nkpwatt D., Musch M., Tschiersch J., Boettner M., Schwab W. Molecular interaction between Methylobacterium extorquens and seedlings: stimulating growth, methanol consumption and localization of the methanol emission site // J Exp Bot. 2006. V.57. P. 4025-4032.
13. Miller V.G., Brandl M.T., Quinones B., Lindou S.E.Biological Sensor for Sucrose: Relative Sensitivity of Various Reporter Genes // Appl Environ Microbiol. 2001. V.67. P.1308-1317.
14. Leveau J.H, Lindow S.E. Epiphytic appetite: quantitative monitoring of the consumption of bacterial sugar in the phyllosphere // Proc Natl Acad Sci USA.-2001. V.98. P. 3446-3453.
15. Huve K, Christ MM, Kleist E, Uerlings R, Niinemets U, et al. Simultaneous growth and emission measurements demonstrate interactive control of methanol release during leaf expansion and stomata // J Exp Bot . 2007. V.58. P. 1783-1793.
16.SalemA.R, HackingA.J, QuayleJ.R. Lack of Mala-CoA Lyase in the Pseudomonas AM1 Mutant // J Gen Microbiol. 1976. V.81. P. 525-527.
17. Harder W, Quayle J.R. The biosynthesis of serine and glycine in Pseudomonas AM1 with particular emphasis on growth on carbon sources other than compounds C1 // Biochem J. 1971. V.121. P. 753-762.
18. Мосин О. В., Игнатов И., Эволюция, метаболизм и биотехнологическое использование метилотрофных микроорганизмов/ Биология в школе, Изд.: ООО «Школьная пресса» - 2013;
19. P.R. Afolabi, F. Mohammed, K. Amaratunga, O. Majekodunmi, S.L. Dales, R. Gill, D. Thompson, J.B. Cooper, S.P. Wood, P.M. Goodwin, C. Anthony. Site-directed mutagenesis and X-ray crystallography of the PQQ- containing quinoprotein methanol dehydrogenase and its electron acceptor, cytochrome CL // Biochemistry. 2001. V.40. P.9799-9809.
20. C. Anthony, P. Williams. The structure and mechanism of methanol dehydrogenase // Biochimica et Biophysica Acta. - 2003.
21. Remi Peyraud, Patrick Kiefer, Philipp Christen, Jean-Charles Portais, Julia A.Vorholt. Co-Consumption of Methanol and Succinate by Methylobacterium extorquens AM1// PLoS ONE. 2012. № 7.
22. Salem, A. R., Wagner, C., Hacking, A. J. & Quayle, J. R. The metabolism of lactate and pyruvate by Pseudomonas AM1 // J Gen Microbiol. 1973. V.76. P. 375-388.
23. Taylor, I. J. & Anthony, C. A biochemical basis for obligate methylotrophy: properties of a mutant of Pseudomonas AM1 lacking 2- oxoglutarate dehydrogenase // J Gen Microbiol. 1976. V.93. P. 259-265.
24. Bolbot, J. A. & Anthony, C. The metabolism of 1,2-propanediol by the facultative methylotroph Pseudomonas AM1 // J Gen Microbiol. 1980. V.120. P. 245-254.
25. Van Dien, S. J. & Lidstrom, M. E. Stoichiometric model for evaluating the metabolic capabilities of the facultative methylotroph Methylobacterium extorquens AM1, with application to reconstruction of C3 and C4 metabolism // Biotechnol Bioeng. 2002. V.78. P. 296-312.
26. Lidstrom, M. E. The genetics and molecular biology of methanol utilizing bacteria. In Methane and Methanol Utilizers, pp. 183-206. Edited by J. C. Murrell & H. Dalton // New York: Plenum. 1992.
27. Van Dien S.J, Okubo Y, Hough M.T, Короткова Н., Taitano T, et al.Methylobacterium extorquens AM1 metabolism recovery of C (3) and C (4) metabolism using transposon mutagenesis // Микробиология. 2003. V.149. P. 601-609.
28. Комов В.П., Шведова В.Н., Биохимия: Учеб. для вузов/ - М.: Дрофа - 2004.
29. Северин Е.С. , Биохимия: Учебник/ Под ред. Е.С. Северина. - 2-е изд., испр. - М.:ГЭОТАР-МЕД - 2004.
30. Полыгалина Г.В., Чередниченко В.С., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. Справочник. М., ДеЛи принт, - 2003.
31. Досон Р., Эллиот Д. Справочник биохимика: Пер. с англ./ Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонсон К. - М.: Мир, 1991.
32. Avezoux A1, Goodwin MG, Anthony C. The role of the novel disulphide ring in the active site of the quinoprotein methanol dehydrogenase from Methylobacterium extorquens // Biochem J. 1995. V.307. P. 735-741.
33. Day, D.J. Methanol dehydrogenase from Methylobacterium extorquens AMi / D.J. Day and C. Anthony // Methods Enzymol. 1990. V. 188. P. 210-216;
34. Грачева И.М., Грачев Ю.П. Лабораторный практикум по технологии ферментативных препаратов: Учебное пособие для вузов. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. - 240 с.
35. Goodwin, M.G.; Avezoux, A.; Dales, S.L.; Anthony, C. Reconstitution of the quinoprotein methanol dehydrogenase from inactive Ca (2+)-free enzyme with Ca2+, Sr2+ or Ba2+ // Biochem. J. 1996. V.319. P. 839-842.
36. Backor M., Fahselt D., Davidson R.D., Wu C.T. Effects of Copper on Wild and Tolerant Strains of the Lichen Photobiont Trebouxia erici (Chlorophyta) and Possible Tolerance Mechanisms // Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 2003. V.45. P. 159-167.
37. Faixova Z., Faix S. Influence of Metal Ions on Ruminal Enzyme Activities // Acta Veterinaria Brno. 2002. V.71. P. 451-455.
38. BRENDA - The Comprehensive Enzyme Information System //
Information on EC 1.1.2.7 - methanol dehydrogenase (cytochrome c): [сайт]. URL: https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=1.1.2.7 (дата
обращения 7.05.2020).
39. C. Anthony.Methanol dehydrogenase, a PQQ-containing quinoprotein dehydrogenase, Sub-Cell // Biochem. 2000. V.35. P. 73-118.
40. Катыкина А.В., Кузнецова Т.А. Изучение специфичности биокатализаторов, полученных из Methylobacterium extorquens pCM16 в присутсвии медматора элетронного транспорта -ферроцена // Школа юных инноваторов: Сборник научных статей Итоговой конференции (10¬17 декабря 2018 года). С.160-163.
41. Кузнецова Т.А. Биокаталитические свойства клеток Methylobacterium extorquensдикого и рекомбинантного штаммов // Известия Тульского государственного университета. Химические науки. 2017. Вып.4. С. 3-10.
42. Berenice Jahn,Niko S. W. Jonasson,Hurina Hu,Helena Singer,
Arjan Pol,Nathan M. Good,Huub J. M. Op den Camp,N. Cecilia Martinez-Gome z,Lena J. Daumann. Understanding the chemistry of the artifcial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster’s Blue in methanol dehydrogenase assays // JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry.2020. V.25. P.199¬212.
43. Parvinder Hothi, Michael J.Sutcliffe, Nigel S.Scrutton. Kinetic isotope effects and ligand binding in PQQ-dependent methanol dehydrogenase // Biochem J.2005.V.388.P.123-133.
44. J. Frank Jr , M. Dijkstra, J.A. Duine, C. Balny. Kinetic and Spectral Studies on the Redox Forms of Methanol Dehydrogenase From Hyphomicrobium X // J. Biochem. 1988. V.174. P.331-338.

🖼 Скриншоты

🛒 Оформить заказ

⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.

🔍 ПОХОЖИЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ

Метанолдегидрогеназа из бесклеточного экстракта метилобактерий M.extorquens pCM160 как биокатализатор амперометрического медиаторного биосенсора Дипломные работы, ВКР химия 2020 г. 4310 руб. ВЛИЯНИЕ НАНОКАПСУЛИРОВАННЫХ ЭКСТРАКТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ НА РОСТ CANDIDA ALBICANS В КУЛЬТУРЕ Магистерская диссертация биология 2018 г. 5550 руб. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МАРМЕЛАДА С БАВ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ Магистерская диссертация пищевые продукты 2018 г. 5750 руб. Исследование и разработка технологии получения гемицеллюлозы из отходов переработки картофеля Бакалаврская работа технология производства продукции 2016 г. 5600 руб. Исследование и разработка технологии получения гемицеллюлозы из отходов переработки картофеля Бакалаврская работа биотехнология 2016 г. 4340 руб. Исследование адгезивных свойств композитных матриксов на основе полигидроксиалканоатов в культуре мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток Бакалаврская работа биология 2016 г. 5600 руб. АНАЛИЗ СВЯЗИ ОПТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ВОДНЫХ ЭКСТРАКТОВ ИЗ ПОЧВ С РЕЗУЛЬТАТАМИ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО БИОТЕСТИРОВАНИЯ Бакалаврская работа физика 2018 г. 5900 руб. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭКСТРАКТА СОЛОДКИ ГОЛОЙ НА ПРОЦЕССЫ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА Диссертация фармакология 2003 г. 5700 руб. Изучение влияния экстракта солодки голой на процессы адаптации организма Диссертации (РГБ) физиология 2003 г. 470 руб. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭКСТРАКТА ПЛОДОВ АРОНИИ ЧЕРНОПЛОДНОЙ (ARONIA MELANOCARPA (Michx.) Elliott} НА РАЗВИТИЕ ДОКСОРУБИЦИН-ИНДУЦИРОВАННОГО АНЕМИЧЕСКОГО СИНДРОМА Дипломные работы, ВКР биология 2018 г. 4550 руб.

📎 БАКАЛАВРСКАЯ РАБОТА ПО ПРЕДМЕТУ «ХИМИЯ»

Найдено работ: 526

Молекулярный докинг ингибиторов PI3K Бакалаврская работа химия 2021 г. 4540 руб. Оптимизация работы аэротенков на примере очистных сооружений ООО «ГазпромТрансгазСургут» Бакалаврская работа химия 2022 г. 4650 руб. Разработка теплообменника для конденсации паров бензиновой фракции в процессе ректификации нефти Бакалаврская работа химия 2022 г. 400 руб. Анализ финансово-хозяйственной деятельности предприятия Бакалаврская работа химия 2023 г. 4365 руб. Разработка математической модели каталитического крекинга вакуумного газойля Бакалаврская работа химия 2022 г. 4360 руб. Определение оптимальных концентраций депрессорных присадок для дизельного топлива Бакалаврская работа химия 2023 г. 4250 руб. ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАБОТЫ УСТАНОВКИ ПОДГОТОВКИ НЕФТИ ЗАПАДНО-СИБИРСКОГО РЕГИОНА Бакалаврская работа химия 2022 г. 4245 руб. Флуориметрическое определение серотонина в растительном сырье Бакалаврская работа химия 2023 г. 4225 руб. Исследование влияния углеводородного состава, физико-химических свойств и концентрации депрессорной присадки на низкотемпературные свойства дизельных топлив Бакалаврская работа химия 2022 г. 4320 руб. Исследование влияния состава сырья на эффективность процесса каталитического риформинга Бакалаврская работа химия 2023 г. 4315 руб. Разработка вольтамперометрической методики определения метилпарабена Бакалаврская работа химия 2023 г. 4200 руб. СИНТЕЗ 6-БРОМ-ТРИПТАМИНА Бакалаврская работа химия 2019 г. 4640 руб. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ НОВЫХ КОМПОЗИЦИОННЫХ МАТЕРИАЛОВ, ПОЛУЧЕННЫХ МОДИФИКАЦИЕЙ АЗОТИСТЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ПОРИСТЫХ ВЕЩЕСТВ Бакалаврская работа химия 2023 г. 4420 руб. ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОКАТАЛИТИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ ПОЛИПРОПИЛЕНА В ПРИСУТСТВИИ АМОРФНЫХ АЛЮМОСИЛИКАТОВ Бакалаврская работа химия 2019 г. 4700 руб. Рентгенофазовый анализ кукурбитурилов Бакалаврская работа химия 2022 г. 4340 руб.
📋 Содержание 📖 Введение ✅ Заключение 📕 Литература 🖼 Скриншоты 🔍 Похожие 🛒 Купить ⬆️

Оценка стоимости

Это краткая форма заказа. После ее заполнения вы перейдете на полную форму заказа работы

Каталог работ (208121)

Поиск работ


©2026 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.