Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


Характеристика свойств метанолдегидрогеназы из бесклеточного экстракта метилобактерий M. extorquens pCM160

Работа №67213

Тип работы

Бакалаврская работа

Предмет

химия

Объем работы63
Год сдачи2020
Стоимость3900 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
53
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


Введение 4
2. Литературный обзор 6
2.1.Общая характеристика метилотрофных бактерий 6
2.2. Структура фермента МДГ и механизм его взаимодействия с
субстратом метанолом 8
2.3. Рост M.extorquens pCM160 на многоуглеродистых субстратах 13
2.4. Кинетика ферментативных реакций 15
2.5. Активность ферментов и методы ее определения 21
2.6. Методы определения активности ферментов: 21
2.6.1. Методы определения активности дегидрогеназ 23
2.7. Характеристики фермента 25
2.8.Заключение 30
3.Экспериментальная часть 31
3.1.Объект исследования 31
3.2. Культивирование метилотрофных бактерий 31
3.3.Определение активности фермента 32
3.4. Количественное определение белка по методу Лоури 33
4.Обсуждение результатов 35
4.1. Культивирование биомассы метилобактерий M.extorquens pCM160 35
4.2. Количественное определение содержания белка 35
4.2.1.Определение активности фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 36
4.3. Характеристики фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 38
4.3.1. Активация фермента МДГ 38
4.3.2.Определение субстратной специфичности фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 41
1. Введение 4
2. Литературный обзор 6
2.1.Общая характеристика метилотрофных бактерий 6
2.2. Структура фермента МДГ и механизм его взаимодействия с
субстратом метанолом 8
2.3. Рост M.extorquens pCM160 на многоуглеродистых субстратах 13
2.4. Кинетика ферментативных реакций 15
2.5. Активность ферментов и методы ее определения 21
2.6. Методы определения активности ферментов: 21
2.6.1. Методы определения активности дегидрогеназ 23
2.7. Характеристики фермента 25
2.8.Заключение 30
3.Экспериментальная часть 31
3.1.Объект исследования 31
3.2. Культивирование метилотрофных бактерий 31
3.3.Определение активности фермента 32
3.4. Количественное определение белка по методу Лоури 33
4.Обсуждение результатов 35
4.1. Культивирование биомассы метилобактерий M.extorquens pCM160 35
4.2. Количественное определение содержания белка 35
4.2.1.Определение активности фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 36
4.3. Характеристики фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 38
4.3.1. Активация фермента МДГ 38
4.3.2.Определение субстратной специфичности фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 41
4.3.3.Определение кинетических параметров фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам 44
4.3.4. Влияние солей металлов на активность фермента МДГ в
бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 46
4.3.5. Стабильность фермента в бесклеточном экстракте M.extorquens
pCM160 при различных условиях хранения 48
4.3.6. рН стабильность фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M.extorquens pCM160 50
4.4. Суммарная таблица по рассмотренным характеристикам 53
Выводы 54
Список использованной литературы 55
Приложения 60


Микроорганизмы представляют особый интерес в современной биотехнологии, так как способны использовать метан и метанол для синтеза полезных продуктов, таких как кормовой белок, пигменты, препараты гомологичных ферментов, рекомбинантные белки, компоненты электронно-транспортной цепи, витамины, коферменты, аминокислоты [1]. Такими микроорганизмами являются метилотрофы, способные использовать окисленные и восстановленные соединения C 1, такие как метан, метанол, метиламин и другие, в качестве единственного источника углерода и энергии [2]. Род Methylobacterium является одним из наиболее распространенных и играет важную роль в научных исследованиях, в частности, для мониторинга уровня токсичных соединений С1 и их последующей биоремедиации [3].
Клетки этих бактерий характеризуются высокой концентрацией периплазматических дегидрогеназ, основной из которых является метанолдегидрогеназа (МДГ) - фермент, катализирующий окисление метанола до формальдегида, а также способный окислять первичные спирты и альдегиды, используя искусственные акцепторы электронов.
В этом году было обнаружено, что многие бактерии, содержащие фермент МДГ, используют в своих активных центрах лантаноиды. Это открытие привело к появлению совершенно новой области исследований - лантаноид-зависимого бактериального метаболизма и биохимии [42]. Поэтому для получения воспроизводимых результатов в данной области исследования, необходим правильный подбор характеристических свойств МДГ. К таким показателям относятся кинетические характеристики фермента, субстратная специфичность МДГ к тому или иному субстрату, определенный диапазон pH, условия хранения биомассы, влияние посторонних примесей в виде солей тяжелых металлов, то есть это условия, при несоблюдении которых может снизится активность фермента.
В связи с этим, целью работы является характеристика свойств фермента МДГ в бесклеточном экстракте Methylobacterium extorquens pCM160.
Для выполнения поставленной цели поставлены следующие задачи:
4
1) Нарастить биомассу бактерий Methylobacterium extorquens pCM160 и получить бесклеточный экстракт для дальнейших исследований;
2) Определить субстратную специфичность и кинетические параметры, такие как константу Михаэлиса, максимальную скорость для фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 по отношению к различным субстратам;
3) Определить влияние солей металлов на активность фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160;
4) Определить стабильность при хранении и рН-стабильность фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160.
5)

Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

1. Нарастили биомассу бактерий Methylobacterium extorquens pCM160 и получили бесклеточный экстракт M.extorquens pCM160, объем которого составил 7,1 мл, исходная концентрация белка 11,04 мг/мл, суммарный белок 78,4 мг;
2. Определили субстратную специфичность фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM16 от концентрации различных субстратов, в результате чего, самый большой ответ приходятся на метанол (максимальная активность 1,362 Ед/мл и удельная активность 0,123 Ед/мг белка);
3. Наибольшее сродство фермента МДГ в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM16 к метанолу КМ = 0,4±0,2 мМ. Максимальные скорости реакции окисления спиртов и альдегидов под действием МДГ для четырех субстратов приблизительно равны: метанол 0,1±0,003 Ед/мг белка, изопропанол 0,1±0,006 Ед/мг белка, трет-бутанол 0,09±0,004 Ед/мг белка, муравьиная кислота 0,093±0,002 Ед/мг белка;
4. При проверке влияния ионов металлов на удельную активность фермента МДГ получились следующие результаты: при добавлении ионов металлов Ga2+- Ba2+, Sr2+ наблюдается увеличение активности МДГ в бесклеточном экстракте на 8-14%; при добавлении ионов металлов Pb2+, Zn2+, Mg2+ и Mn2+ наблюдается незначительное снижение активности на 7¬10%; при добавлении солей тяжелых металлов (Со2+) происходит сильное ингибирование на 55% и полное подавление активности раствором соли Gu2+.
5. Определили стабильность фермента в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 при +4oC и -20oC , получили следующие результаты: при +4oC активность фермента снижается на 85% на седьмые сутки, а потом полностью отсутствует после седьмых суток; при -20oC за 60 суток активность уменьшается на 31%.
6. Определили рН стабильность фермента в бесклеточном экстракте M.extorquens pCM160 , максимальная активность которого наблюдается в диапазоне pH 7-11.
7.



1. Ю. А. Троценко. Аэробные метилотрофы - перспективные объекты современной биотехнологии // Журнал Сибирского федерального университета. Биология. 2012. Т. 5. № 3. С. 243-279.
2. Nakagawa T., Mitsui R., Tani A., Sasa K., Tashiro S., Iwama T., Hayakawa T., Kawai K. A catalytic role of XoxF1 as La3+-dependent methanol dehydrogenase in Methylobacterium extorquens strain AM1 // PLoS ONE. 2012. V. 7. № 11;
3. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs // New York, NY: Academic Press - 1982.
4. Цыганков Ю.Д. Физиологическая характеристика метилотрофных бактерий. Биология термофильных микроорганизмов // Ю.Д. Цыганков. - Москва: Наука. 1986. C. 31- 50.
5. Lidstrom M.E. Aerobic methylotrophic prokaryotes // New York: Springer-Verlag. 2006. Chapter 1.20.P. 618-634.
6. Elizabeth Skovran; Gregory J. Crowther; Xiaofeng Guo; Song Yang; Mary E. Lidstrom. A Systems Biology Approach Uncovers Cellular Strategies Used by Methylobacterium extorquens AM1 During the Switch from Multi- to Single-Carbon Growth // PLoS ONE. 2012. № 5.
7. A.Y.Chistoserdov, L.V.Chistoserdova, W.S.McIntire, M.E.Lidstrom. Genetic organization of the mau gene cluster in Methylobacterium extorquens AM1: complete nucleotide sequence and generation and characteristics of mau mutants // J Bacteriol. 1994. V. 176. P. 4052 - 4065.
8. Delmotte N., Knief S., Chaffron G., Innerebne, B., Roschitzki R., Schlapba, C., von Mering, and J. A. Vorholt. Community proteogenomics reveals insights into the physiology of phyllosphere bacteria // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009. V. 106. P. 16428-16433.
9. Corpe Washington. Method for detecting methylotrophic bacteria on solid surfaces // J. Microbiol. 1985. V.3. P. 215-221.
10. W.A.Corpe, S.Rheem. Ecology of methylotrophic bacteria on the surface of living leaves // FEMS Microbiol Ecol. 1989. V. 62. P.243-250.
11. Kneff S., Delmontt Н., Saffron S., Stark М., Innebner G.,Wassman Р., von Mering S., Worholt I.A // ISME. 2012. V.6. P. 1378-1390.
12. Abanda-Nkpwatt D., Musch M., Tschiersch J., Boettner M., Schwab W. Molecular interaction between Methylobacterium extorquens and seedlings: stimulating growth, methanol consumption and localization of the methanol emission site // J Exp Bot. 2006. V.57. P. 4025-4032.
13. Miller V.G., Brandl M.T., Quinones B., Lindou S.E.Biological Sensor for Sucrose: Relative Sensitivity of Various Reporter Genes // Appl Environ Microbiol. 2001. V.67. P.1308-1317.
14. Leveau J.H, Lindow S.E. Epiphytic appetite: quantitative monitoring of the consumption of bacterial sugar in the phyllosphere // Proc Natl Acad Sci USA.-2001. V.98. P. 3446-3453.
15. Huve K, Christ MM, Kleist E, Uerlings R, Niinemets U, et al. Simultaneous growth and emission measurements demonstrate interactive control of methanol release during leaf expansion and stomata // J Exp Bot . 2007. V.58. P. 1783-1793.
16.SalemA.R, HackingA.J, QuayleJ.R. Lack of Mala-CoA Lyase in the Pseudomonas AM1 Mutant // J Gen Microbiol. 1976. V.81. P. 525-527.
17. Harder W, Quayle J.R. The biosynthesis of serine and glycine in Pseudomonas AM1 with particular emphasis on growth on carbon sources other than compounds C1 // Biochem J. 1971. V.121. P. 753-762.
18. Мосин О. В., Игнатов И., Эволюция, метаболизм и биотехнологическое использование метилотрофных микроорганизмов/ Биология в школе, Изд.: ООО «Школьная пресса» - 2013;
19. P.R. Afolabi, F. Mohammed, K. Amaratunga, O. Majekodunmi, S.L. Dales, R. Gill, D. Thompson, J.B. Cooper, S.P. Wood, P.M. Goodwin, C. Anthony. Site-directed mutagenesis and X-ray crystallography of the PQQ- containing quinoprotein methanol dehydrogenase and its electron acceptor, cytochrome CL // Biochemistry. 2001. V.40. P.9799-9809.
20. C. Anthony, P. Williams. The structure and mechanism of methanol dehydrogenase // Biochimica et Biophysica Acta. - 2003.
21. Remi Peyraud, Patrick Kiefer, Philipp Christen, Jean-Charles Portais, Julia A.Vorholt. Co-Consumption of Methanol and Succinate by Methylobacterium extorquens AM1// PLoS ONE. 2012. № 7.
22. Salem, A. R., Wagner, C., Hacking, A. J. & Quayle, J. R. The metabolism of lactate and pyruvate by Pseudomonas AM1 // J Gen Microbiol. 1973. V.76. P. 375-388.
23. Taylor, I. J. & Anthony, C. A biochemical basis for obligate methylotrophy: properties of a mutant of Pseudomonas AM1 lacking 2- oxoglutarate dehydrogenase // J Gen Microbiol. 1976. V.93. P. 259-265.
24. Bolbot, J. A. & Anthony, C. The metabolism of 1,2-propanediol by the facultative methylotroph Pseudomonas AM1 // J Gen Microbiol. 1980. V.120. P. 245-254.
25. Van Dien, S. J. & Lidstrom, M. E. Stoichiometric model for evaluating the metabolic capabilities of the facultative methylotroph Methylobacterium extorquens AM1, with application to reconstruction of C3 and C4 metabolism // Biotechnol Bioeng. 2002. V.78. P. 296-312.
26. Lidstrom, M. E. The genetics and molecular biology of methanol utilizing bacteria. In Methane and Methanol Utilizers, pp. 183-206. Edited by J. C. Murrell & H. Dalton // New York: Plenum. 1992.
27. Van Dien S.J, Okubo Y, Hough M.T, Короткова Н., Taitano T, et al.Methylobacterium extorquens AM1 metabolism recovery of C (3) and C (4) metabolism using transposon mutagenesis // Микробиология. 2003. V.149. P. 601-609.
28. Комов В.П., Шведова В.Н., Биохимия: Учеб. для вузов/ - М.: Дрофа - 2004.
29. Северин Е.С. , Биохимия: Учебник/ Под ред. Е.С. Северина. - 2-е изд., испр. - М.:ГЭОТАР-МЕД - 2004.
30. Полыгалина Г.В., Чередниченко В.С., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. Справочник. М., ДеЛи принт, - 2003.
31. Досон Р., Эллиот Д. Справочник биохимика: Пер. с англ./ Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонсон К. - М.: Мир, 1991.
32. Avezoux A1, Goodwin MG, Anthony C. The role of the novel disulphide ring in the active site of the quinoprotein methanol dehydrogenase from Methylobacterium extorquens // Biochem J. 1995. V.307. P. 735-741.
33. Day, D.J. Methanol dehydrogenase from Methylobacterium extorquens AMi / D.J. Day and C. Anthony // Methods Enzymol. 1990. V. 188. P. 210-216;
34. Грачева И.М., Грачев Ю.П. Лабораторный практикум по технологии ферментативных препаратов: Учебное пособие для вузов. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. - 240 с.
35. Goodwin, M.G.; Avezoux, A.; Dales, S.L.; Anthony, C. Reconstitution of the quinoprotein methanol dehydrogenase from inactive Ca (2+)-free enzyme with Ca2+, Sr2+ or Ba2+ // Biochem. J. 1996. V.319. P. 839-842.
36. Backor M., Fahselt D., Davidson R.D., Wu C.T. Effects of Copper on Wild and Tolerant Strains of the Lichen Photobiont Trebouxia erici (Chlorophyta) and Possible Tolerance Mechanisms // Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 2003. V.45. P. 159-167.
37. Faixova Z., Faix S. Influence of Metal Ions on Ruminal Enzyme Activities // Acta Veterinaria Brno. 2002. V.71. P. 451-455.
38. BRENDA - The Comprehensive Enzyme Information System //
Information on EC 1.1.2.7 - methanol dehydrogenase (cytochrome c): [сайт]. URL: https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=1.1.2.7 (дата
обращения 7.05.2020).
39. C. Anthony.Methanol dehydrogenase, a PQQ-containing quinoprotein dehydrogenase, Sub-Cell // Biochem. 2000. V.35. P. 73-118.
40. Катыкина А.В., Кузнецова Т.А. Изучение специфичности биокатализаторов, полученных из Methylobacterium extorquens pCM16 в присутсвии медматора элетронного транспорта -ферроцена // Школа юных инноваторов: Сборник научных статей Итоговой конференции (10¬17 декабря 2018 года). С.160-163.
41. Кузнецова Т.А. Биокаталитические свойства клеток Methylobacterium extorquensдикого и рекомбинантного штаммов // Известия Тульского государственного университета. Химические науки. 2017. Вып.4. С. 3-10.
42. Berenice Jahn,Niko S. W. Jonasson,Hurina Hu,Helena Singer,
Arjan Pol,Nathan M. Good,Huub J. M. Op den Camp,N. Cecilia Martinez-Gome z,Lena J. Daumann. Understanding the chemistry of the artifcial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster’s Blue in methanol dehydrogenase assays // JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry.2020. V.25. P.199¬212.
43. Parvinder Hothi, Michael J.Sutcliffe, Nigel S.Scrutton. Kinetic isotope effects and ligand binding in PQQ-dependent methanol dehydrogenase // Biochem J.2005.V.388.P.123-133.
44. J. Frank Jr , M. Dijkstra, J.A. Duine, C. Balny. Kinetic and Spectral Studies on the Redox Forms of Methanol Dehydrogenase From Hyphomicrobium X // J. Biochem. 1988. V.174. P.331-338.

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.



Подобные работы


©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.