Список сокращений 6
Введение 8
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Дегенеративные изменения в нейронах при Болезни Альцгеймера 12
1.2. Динамические микротрубочки и плюс-концевые белки в нейронах 15
1.3 Семейство белков EB 19
Глава 2. Материалы и методы 23
2.1. Выделение первичной нейрональной культуры гиппокампа 23
2.2. Ведение первичной гиппокампальной культуры 24
2.3. Ведение клеточной линии HEK 293T 24
2.4. Кальций-фосфатная трансфекция первичных гиппокампальных нейронов 24
2.5. Сборка лентивирусных частиц 25
2.6. Вестерн-блот анализ 25
2.7. Приготовление Л042 олигомеров 26
2.8. Иммуноцитохимическое окрашивание 27
2.9. Конфокальная микроскопия 27
2.10. Изучение морфологии дендритных шипиков нейронов 28
2.11. Анализ распределения постсинаптического белка PSD-95 28
2.12. Статистический анализ 28
Глава 3. Результаты 30
3.1. Проверка эффективности вирусной трансдукции в первичной нейрональной гиппокампальной культуры 30
3.2. Влияние вирус-опосредованной гиперэкспрессии и нокдауна белков EB3 на плотность и размер кластеров белка PSD-95 в дендритах первичных гиппокампальных нейронов 31
3.3 Влияние вирус-опосредованной гиперэкспрессии белков EB3 в условиях низкой амилоидной токсичности на плотность и размер кластеров белка PSD-
95 в дендритах первичных гиппокампальных нейронов 32
3.4 Влияние гиперэкспрессии белка EB3 на морфологию дендритных
шипиков в условиях низкой амилоидной токсичности 34
Заключение 36
Выводы 37
Список используемых источников 38
Актуальность исследования
Множество нейродегенеративных заболеваний, в частности, болезнь Альцгеймера (БА), характеризуются нарушением в формировании синаптических контактов или потерей их стабильности. Специализированные мембранные выросты - дендритные шипики, формирующие контакт между аксоном и дендритом, подвергаются постоянному изменению в форме и плотности. Ранее считалось, что цитоскелет дендритных шипиков представлен исключительно актином, а тубулин участвует лишь в формировании дендритов и аксонов. Недавно было показано, что динамические тубулиновые микротрубочки способны временно проникать в дендритный шипик, регулируя синаптическую пластичность [36]. Однако в настоящее время данное явление изучено недостаточно, поэтому проведение исследований в данном направлении крайне актуальны.
Плюс-концевой белок end-binding protein 3 (EB3) крепится к
положительному концу нейрональных тубулиновых микротрубочек. Нейропротекторная функция EB3 продемонстрирована только на одной мышиной линии PS1-M146V-KI [56], моделирующей БА. Данная линия характеризуется экспрессией белка Пресенилина 1 с мутацией характерной для наследственной формы данного заболевания, а также отсутствием выраженного накопления бета-амилоида в головном мозгу грызунов.
Для подтверждения нейропротекторного потенциала белка EB3 необходимо оценить влияние данного белка также в условиях низкой амилоидной токсичности, моделирующей болезнь Альцгеймера. БА является одной из самых распространенных форм деменции, которая поражает пожилых людей. Однако на сегодняшний день данное заболевание считается неизлечимым, поэтому исследования в данной области необходимы для разработки эффективной терапии, предотвращающей дегенеративные изменения в синапсах.
Объект и предмет исследования
В данной работе рассмотрено влияние белка EB3 на морфологию дендритных шипиков в условиях амилоидной токсичности на первичной нейрональной гиппокампальной культуре.
Теоретическая и методологическая база исследования
При написании выпускной квалификационной работы были использованы российские и зарубежные источники по соответствующей тематике. Исследования производились с использованием материалов и методов, применяющихся в Лаборатории молекулярной нейродегенерации СПбПУ. В ходе работы были освоены следующие методы: культивирование диссоциированных нейронов гиппокампа мышей, ведение клеточной линии HEK293T, сборка лентивирусов, Вестерн-блот анализ, иммуноцитохимический анализ, выделение плазмидной ДНК, кальций-фосфатная трансфекция нейронов, конфокальная микроскопия, анализ морфологии дендритных шипиков в программном обеспечении NeuronStudio, деконволюция конфокальных изображений, бинаризация изображений, анализ размера и плотности кластеров в программном обеспечении Synpanal.
Степень научной разработанности проблемы
Снижение плотности дендритных шипиков продемонстрировано в различных мышиных моделях, таких как PS1-M146V-KI [56], APP-KI [75], APPPS1 [57]. Однако, влияние белка EB3 на морфоло рассмотрено только на мышах линии PS1-М146V-KI. Данная трансгенная линия характеризируется мутацией M146V в белке Пресенилине 1, однако в нейронах мышей линии PS1- М146V-KI не происходит характерное для БА накопление бета-амилоида [56].
EB3 взаимодействует также с белком постсинаптической плотности 95 (PSD-95, Postsynaptic density protein-95), способствуя модуляции динамики МТ во время образования дендритов [69]. PSD-95 является маркерным белком для постсинаптической плотности, которая состоит из большого количества рецепторов, регуляторных белков и молекул, принимающие участие в синаптической передаче. Впервые рассмотрено влияние гиперэкспрессии и нокдауна EB3 на плотность и размер кластеров белка PSD-95 в дендритах гиппокампальных нейронов в норме и в условиях амилоидной токсичности.
Научная новизна и практическая значимость
В данной работе исследуется влияние белка EB3 на гиппокампальные нейроны в норме и при воздействии олигомерами бета-амилоида в низкой концентрации. Ранее подобные исследования не проводились, и полученные результаты позволяют сделать предположения о роли динамических тубулиновых микротрубочек в функционировании нейронов. Произведение оценки нейропротекторного потенциала белка EB3 позволит разработать новые механизмы и мишени для предотвращения дегенеративных изменений в гиппокампальных нейронах при БА, ассоциированных с (=являющихся причиной) прогрессирующей потерей памяти у пациентов.
На основе полученных результатов, можно предположить о перспективности использования белка EB3 в качестве возможной терапевтической мишени для создания лечения БА.
Цель и задачи исследования
Цель исследования - изучить влияние гиперэкспрессии и нокдауна белка ЕВ3 на гиппокампальные нейроны в норме и на клеточной модели болезни Альцгеймера.
Для реализации цели были поставлены следующие задачи:
1. Осуществить сборку вирусов для гиперэкспрессии и нокдауна белка ЕВ3 и определить их оптимальную концентрацию для воздействия на первичные гиппокампальные нейроны;
2. Разработать методический подход для анализа плотности и размера кластеров белка PSD-95 в дендритах нейронов;
3. Оценить влияние вирус-опосредованной гиперэкспрессии и нокдауна белка EB3 на плотность и размер кластеров постсинаптического белка PSD-95 в дендритах первичных гиппокампальных нейронов в норме и в условиях низкой амилоидной токсичности;
4. Изучить влияние гиперэкспрессии и нокдауна белка EB3 на плотность дендритных шипиков и ширину их головки в норме и в условиях низкой амилоидной токсичности.
Белок EB3, стабилизирующий полимеризующиеся микротрубочки, крепится к положительному концу нейрональных тубулиновых микротрубочек. В предыдущих исследованиях было продемонстрировано влияние уровня экспрессии белка EB3 в нейронах на морфологию дендритных шипиков [77]. Гиперэкспрессия EB3 увеличивает количество грибовидных шипиков и способна восстановить их дефицит на мышиной модели БА [56].
Известно, что белок EB3 взаимодействует с белком PSD-95, способствуя модуляции динамики МТ во время образования дендритов [69]. В предыдущих исследованиях показана связь между кластеризацией белка PSD-95 и стабильностью дендритного шипика in vivo [9], в связи с чем, было принято решение оценить влияние вирус-опосредованной гиперэкспрессии и нокдауна белка EB3 на плотность и размер кластеров постсинаптического белка PSD-95 в дендритах первичных гиппокампальных нейронов в норме и в условиях низкой амилоидной токсичности.
В данном исследовании показано, что гиперэкспрессия белка EB3 увеличивает ширину головки грибовидных шипиков в первичных гиппокампальных нейронах. Гиперэкспрессия белка EB3 в условиях низкой амилоидной токсичности, моделирующих БА, предотвращает уменьшение числа шипиков и сокращение размера их головки. Увеличение размера головки грибовидных шипиков коррелирует с силой синапса и размером постсинаптической плотности.
Продемонстрировано влияние гиперэкспрессии и нокдауна белка EB3 на плотность и размер кластеров белка PSD-95 в дендритах гиппокампальных нейронов в норме и в условиях амилоидной токсичности. Для подсчета плотности и размера кластеров PSD-95 в работе был разработан алгоритм с применением локальной бинаризации и программы Synpanal. Гиперэкспрессия белка EB3 вызывает увеличение плотности кластеров белка PSD-95 в сравнении с контрольной группой, но не изменяет их размер. Нокдаун белка ЕВ3 уменьшает размер и плотность кластеров белка PSD-95.
На основе полученных результатов, можно предположить о перспективности изучения белка EB3 в качестве возможной мишени для создания лечения БА.
Выводы:
1. При помощи Вестерн-блот анализа продемонстрирована эффективность собранных лентивирусных частиц для управления экспрессией белка ЕВ3 и определена оптимальная нетоксичная концентрация лентивирусов для воздействия на первичные гиппокампальные нейроны;
2. Разработан и успешно применен метод анализа плотности и размеров кластеров белка PSD-95 в дендритах нейронов. Метод основан на коррекции фона и устранении шума изображений, с последующим применением локальной бинаризации изображений для выделения кластеров белка PSD-95, полученных с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии;
3. Гиперэкспрессия белка EB3 вызывает увеличение ширины головки дендритных шипиков и увеличение плотности кластеров белка PSD-95 в сравнении с контрольной группой, но не изменяет их размер. Вирус- опосредованный нокдаун белка EB3 приводит к значительному уменьшению плотности и размера кластеров постсинаптического белка PSD-95.
4. В условиях низкой амилоидной токсичности происходит снижение головки и плотности дендритных шипиков. Гиперэкспрессия белка EB3 предотвращает снижение количества дендритных шипиков в гиппокампальных нейронах и увеличивает ширину их головки, а также увеличивает плотность кластеров белка PSD-95. Полученные результаты позволяют сделать вывод о нейропротекторном свойстве данного белка на клточной модели БА.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
