Введение 3
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6
1.1 Физические основы функционирования липидно-пептидных систем 6
1.1.1 Структура и свойства биологических мембран 6
1.1.2 Модельные мембраны и их классификация 10
1.1.3 Структура и свойства пептидов 12
1.2 Липидно-протеиновые взаимодействия. Физические методы исследования. Роль 31P и 2Н ЯМР спектроскопии 18
1.2.1 Липидно-протеиновое взаимодействие. Специфическое липидно-пептидное взаимодействие 18
1.2.2 Основы ЯМР 23
1.2.3 Метод 31P и 2Н ЯМР спектроскопии в изучении модельных липидно-протеиновых систем 29
2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1 Объекты исследования 35
2.2 Приготовление образцов 40
2.3 Параметры экспериментальной аппаратуры 42
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 44
3.1 Результаты, полученные методом 31P ЯМР спектроскопии 44
3.2 Результаты, полученные методом 2Н ЯМР спектроскопии 59
ВЫВОДЫ 70
ЛИТЕРАТУРА 71
Физика конденсированного состояния является обширнейшей областью, включающей в себя множество подразделов. Среди наиболее динамично развивающихся из них можно выделить так называемый «Soft matter» - уникальное междисциплинарное направление, находящееся на стыке физики, химии и биологии. Это научное направление зародилось в 1970-х годах.
Одним из наиболее активно изучаемых классов объектов этого направления являются биологические системы, и, в частности, биомембраны и их модели. Дисциплина, в рамках которой происходят исследования этих объектов, называется «биомембранология». Она сосредоточена на получении информации о структурно-динамических свойствах биологических мембран, поскольку они представляют собой двумерную жидкокристаллическую систему, которая существует за счет физических взаимодействий. Физический аспект функционирования биологических мембран и подобных систем интенсивно исследуются при помощи всего арсенала современных физических методов, одним из основных из которых является метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Одной из актуальных задач, решаемых при помощи вышеописанного подхода, является изучение взаимодействия биологических мембран с антимикробными пептидами (АМП), и, в частности, протегринами. Научный интерес к протегринам обусловлен их антибактериальной, противогрибковой и противовирусной активностью как части иммунной системы млекопитающих [1,2]. При этом, поскольку механизм действия АМП на бактерии предполагает участие специфического липидно-пептидного взаимодействия, то АМП рассматриваются в качестве нового класса антибиотиков естественного происхождения [3,4]. Также считается, что именно благодаря такому механизму действия антибиотики на основе АМП не будут подвержены снижению эффективности, связанной с вырабатыванием резистентности у бактерий [5]. Очевидно, что для создания
таких лекарственных средств необходимо детальное и глубокое понимания механизма взаимодействия АМП с липидными мембранами.
Среди опубликованных работ, из которых можно получить некоторое представление о характере специфического липидно-пептидного взаимодействия, превалируют публикации предполагающие, что при внедрении в липидную систему пептиды формируют амфипатические структуры, одновременно содержащие положительно заряженные (или гидрофильные) и гидрофобные области [6]. Взаимодействие подобных дифильных образований с липидным бислоем приводит к структурным изменениям в мембране, таким как нарушения упорядоченности мембраны, формирование неламеллярных включений, мицелл, образование тороидальных пор и т.д. [4,7].
Несмотря на то, что большинство публикаций посвящено получению структурной информации о состоянии Протегринов [8,9,10,11], одна из альтернативных стратегий заключается в изучении интегральных свойств системы, таких как фазовое поведение мембраны, подвижность молекулярных компонент системы и т.п. В рамках данного подхода наиболее информативными представляются методы ЯМР-спектроскопии твердого тела, а в частности ее разновидности на ядрах 31P и 2H, которые и применялись в представленной работе. Также, отметим, что в рамках этого исследования была поставлена задача оценить влияние первичной структуры Протегринов на характер их взаимодействия с модельной мембраной и, как следствие, на ее интегральные свойства. С этой целью проводились эксперименты с модельными липидными системами, содержащими пептиды Протегрин-1, Протегрин-2, Протегрин-3, Протегрин-4 и Протегрин-5, имеющими различие в длине и составе аминокислотной последовательности [12]. Кроме того, если Протегрин-1 и его взаимодействие с липидами достаточно хорошо изучено [13,14], то остальные пептиды в данном аспекте исследуется впервые. Кроме того, особое внимание уделяется исследованию влияния температуры на характер взаимодействия и фазовое состояние мембраны. Для эксперимента был выбран диапазон температур, включающий точку основного фазового перехода гель - жидкий кристалл для исследованного липида.
Все измерения проведены на оборудовании ФЦКП ФХИКФУ. Работа выполнена при поддержке РФФИ гранта мол а № 14-04-31675.
1. Данные, полученные при помощи методов 2H и 31P ЯМР спектроскопии, позволяют заявить, что все исследованные пептиды при обеих концентрациях оказывают влияние на структурные свойства мембраны, следовательно, во всех случаях происходит взаимодействие Протегринов с бислоем.
2. Выявлено существенное различие во влиянии на степень упорядоченности гидрофобной части бислоя между пептидами ПГ-1, ПГ-2, ПГ-3 и ПГ-4, ПГ-5, предположительно обусловленное различием в конфигурации 0-изгиба между этими пептидами.
3. При молярной концентрации пептидов ПГ-1, ПГ-2 в 4% наблюдается образование изотропной фазы и упорядочение ацильных цепей липида в фазе геля - предположительно происходит встраивание димерных пептидных структур в бислой.
4. Протегрин-1 в концентрации в 4 % активирует процесс разрушения интегральной структуры мембраны, предположительно происходящий благодаря образованию олигомеров из нескольких димерных структур пептидных молекул, которые встраиваются в бислой.
5. Протегрин-5 наиболее сильно разупорядочивает ацильные цепи и меняет конфигурацию гидрофильной части бислоя среди всех пептидов, не нарушая целостности мембраны.
