Изучение влияния внешнего газового давления на магнитную релаксацию воды в клетках растений. Исследование методом ядерного магнитного резонанса спин-эхо
Введение в актуальность проблемы 3
Цель исследования 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Физические основы давления 8
Ключевые понятия транспорта воды в растениях 10
Давление в растительных объектах 13
ЯМР в исследованиях давления 14
Итоги литературного обзора 17
2. МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТА
Метод ЯМР 19
Импульсный градиент магнитного поля 25
Самодиффузия 30
Метод Карра-Парселла 32
Парамагнетики 34
Диффузионный метод спинового эха с импульсным градиентом магнитного поля 35
3. ОПИСАНИЕ УСТАНОВКИ И ОБРАЗЦОВ
Установка спин-эхо ЯМР диффузометр-релаксометр 38
Описание образцов 42
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 46
ВЫВОДЫ 57
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 59
Исследование влияния давления может оказаться крайне благодарной работой: несмотря на то, что данная тематика имеет богатый исторический фундамент - эксперименты многих и многих учёных, их труды были связаны с диапазонами области высоких давлений, порядка КБар, в то время как давления, присущие биологическим объектам, в том числе и первую очередь, растениям, являются не то, чтобы совсем не изученными, но вопрос остаётся достаточно открытым. Возвращаясь к теме физиологических объектов: скачки давления, его пагубное, или напротив, действие, изучение его – может дать старт для фундаментальных исследований в области своевременной диагностики инфарктов, инсультов, даже тромбов. Прежде всего, конечно, стоит понять эффекты и влияние, оказываемые давлением на объекты устройством более простым – растительные клетки. Впрочем, говоря о растениях, стоит отметить, что данный эффект может оказаться чуть более фундаментальным, чем полагается ныне, и помимо того, что в различных своих проявлениях как: осмотическое, гравитационное, транспирационное давления, является движущей силой переноса, согласно «гидравлической теории» быстроизменяющееся гидродинамические параметры могут быть переносчиком сигнальной информации с огромной скоростью: до 1500 м/сек. Кроме того, устоявшиеся теории о процессе транспорта воды на огромные расстояния вверх по стволу деревьев от корней к листьям, тоже не дают ясной картины о данном явлении, ведь иногда речь идёт о дистанции порядка сотни метров. Применительно к проблеме водного переноса эксперименты с давлением требуют решения методических вопросов реализации неразрушающего контроля транспорта воды, синхронизированного с фактором давления, определения мишеней для давления и т.п.
Несмотря на актуальность проблемы транспорта воды в растениях, как процесса определяющего продуктивность растений в наибольшей степени, нет ясности по составляющим системы движущих сил переноса воды.
На сегодняшний день в растениях остаются неясными: движущие силы корневого давления, причины и роль автоколебательного режима корневого давления; движущие силы транспорта воды на десятки метров, особенно в межсезонные периоды; механизмы устойчивости метастабильного состояния воды в сосудистой системе растения под отрицательным давление; механизмы исключения газовой эмболии сосудов в межсезонье, механизмы и сигналы к переключению путей транспорта воды при изменении внешних условий.
Перспективным подходом к решению некоторых задач представляется регистрация и анализ реакции гидродинамической системы растения на возмущающее действие внешнего давления. [1] В свою очередь, растительные клетки имеют много общего с организацией животных клеток и, следовательно, могут быть удобными фантомами-посредниками в исследованиях влияния давления. В результате изучения реакции клеток на давление, применительно к животным объектам может дать новую информацию к развитию патологических процессов, сопровождающих повышение артериального давления (инфаркты, инсульты), процессов происходящих под влиянием давления - ускорения, процессов адаптации от невесомости к гравитационной силе.
В исследованиях такого рода важно понимать, что любое воздействие на клетку биологического объекта может дать нам неверные данные эксперимента, неадекватные реальным процессам. Исходя из этого, наилучшим из способов изучения представляется метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), ввиду его особенностей неинвазивности.
Использование сегментов корней применительно к исследованиям водообмена имеет ряд особенностей связанных, прежде всего, с очевидным фактом прерывания ксилемных, флоэмных каналов переноса водных растворов и сброса давления в гидросистеме растения. Как следствие, изучение водообмена на сегментах корней в основном, ограничиваются рамками ближнего транспорта воды. Значительная часть результатов по ближнему транспорту воды получены на сегментах методом спинового эха ЯМР. Последний позволяет регистрировать скорость трансмембранного обмена воды, а в сочетании с техникой импульсного градиента магнитного поля коэффициенты диффузии воды селективно исследовать водный перенос по различным путям в растительных тканях.
При отсечении сегмента корня от материнского растения в числе ожидаемых причин изменения водопереноса может быть:
1) - изменение суммарного сопротивления переносу воды из-за исключения сопротивления отсеченных, не корневых фрагментов растения. На примере виноградной лозы (Vitis vinifera L.), сои (Glycine max L.) и кукурузы (Zea mays L.)¸показано, что отсечение верхушки побега приводит к уменьшению гидравлической проводимости корня. Интерпретация причин связывается как с ксилемозависимыми гидравлическими сигналами , так и со снижением экспрессии ряда аквапоринов ;
2) - изменение градиента межклеточного водного потенциала из-за прекращения оттока воды по ксилеме и флоэме;
3) - падения давления в гидросистеме корня и как следствие, изменение проницаемости плазмалеммы и проводимости плазмодесм. По данным изученной литературы давление в ксилеме может достигать 5-6 бар. Сравнительно высокое - до 4 МПа, внешнее давление воздуха может приводить к изменениям переноса по симпласту. В работе Опарка на примере листьев трихомы табака (Nicotiana clevelandii) с использованием красителей показан факт необратимой блокировки плазмодесм при градиенте давления между клетками в 200 кПа. Наконец, в теоретической работе Ортеги прогнозируется время-зависящая реакция межклеточного переноса в ответ на внешнее давление.
Ко всему прочему имеется еще один рычаг влияния фактора давления на межклеточный перенос: из-за наличия воздухо-заполленных межклетников изменение давления приводит к изменению равновесного уровня концентрации растворенных в воде апопласта и симпласта газов воздуха и, разумеется, кислорода. Изменение концентрации растворенного кислорода в сегментах, при изменениях внешнего давления воздуха, продемонстрировано ЯМР экспериментами, причем даже типичные, метеорологические изменения атмосферного давления отражаются на величине времен магнитной релаксации воды в растительных тканях. Надо полагать, что с уровнем растворенного кислорода коррелирует уровень активных форм кислорода «reactive oxygen species» - ROS . В литературе представлены данные изменений гидравлической проводимости корня при накоплени ROS. К числу механизмов влияния ROS на гидравлическую проводимость относится процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) и/или модуляция активности аквапоринов. Наконец, из-за наличия воздухоносных межклетников изменения давления могут приводить к механическим деформациям в архитектуре растительной ткани и, как следствие, активации мх сенсоров участвующих в регуляции разнообразных процессов метаболизма, в том числе водопереноса.
Ко всем прочим уже известным причинам использования сегментов в качестве исследуемых образцов, связаны с методическими возможностями проведения исследований в тех случаях, когда работа на интактных растениях затруднена или даже невозможна. С другой стороны, отсечение вызывает стресс и этот факт, используются для изучения накопления избыточного количества АФК (reactive oxygen species-ROS), кинетики переходных процессов. В итоге факт отсечения как кардинальное воздействие на растение с необходимостью расширяет круг задач исследования. В частности, остается ли сегмент вполне жизнеспособным, сохраняются ли у сегмента в какой степени и на какое время ростовые функции, не происходит ли блокировка межклеточного переноса воды в сегменте корня, как защитная реакция на опасность потери воды через зону рассечения.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучение влияния внешнего газового давления на магнитную релаксацию воды в клетках растений, а также насколько значительно изменяется межклеточный перенос воды в сегменте после его отсечения от материнского растения: исследование методом спин-эхо ЯМР. Изучить влияние на релаксацию давления составляющих газов воздуха: кислорода, азота, углекислого газа.
Отработать технологию спин-эхо ЯМР экспериментов по регистрации релаксационных и диффузионных параметров в биологических объектах под давлением. Исследовать динамику изменения релаксационных параметров воды в клетках наземных (Zea maysL.) и водных (Chlorella vulgaris) растений под действием давления воздуха.
На основе диффузионных экспериментов оценить насколько значительно изменяется межклеточный перенос воды в растительном сегменте из-за сброса давления в сосудистой системе после его отсечения от материнского растения.
Положительное по отношению к атмосферному давление воздуха приводит к увеличению скорости магнитной релаксации воды в растительной ткани, отрицательное давление – к снижению.
В то же время другие компоненты, содержащиеся в атмосферном воздухе – азот и углекислый газ, не влияют на магнитную релаксацию воды, из чего можно сделать вывод, что причина изменений времён релаксации связана с растворением под давлением дополнительного объема кислорода воздуха (кислородный допинг). Под давлением концентрация кислорода в клетках кукурузы линейно растет от времени до достижения равновесного состояния.
Кислород, растворенный при атмосферном давлении, является заметным источником релаксации воды в клетках растений. Колебания атмосферного давления, которые зачастую не учитываются при измерениях времён релаксации, могут быть одной из причин разброса экспериментальных релаксационных данных, причём было установлено, что чем больше давление воздуха, тем сильнее падает амплитуда сигнала спин эхо, напрямую связанного с Т2 спин спиновой релаксацией воды. Причём, как было установлено, увеличение количества принятого клетками кислорода ведёт к пропорциональному ускорению магнитной релаксации протонов воды, что может быть полезно для исследований проблемы преждевременной диагностики таких тромбовых болезней как инсульта, например.
При интерпретации экспериментов, где рутинно используется известная процедура вакуумной инфильтрации, должен учитываться факт изменения равновесного содержания в клетках кислорода. Под давлением концентрация кислорода в растительных клетках линейно растет от времени до достижения равновесного состояния ткани с демонстрацией аддитивности влияния давления.
Сброс давления в каналах переноса воды (ксилемме и флоэмме) при рассечении интактного растения на сегменты с последующей фрагментацией сегментов приводит к монотонному уменьшению эффективного коэффициента межклеточной проницаемости. Отсечение сегмента от материнского растения не приводит к драматическим изменениям в межклеточном диффузионном переносе воды.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
