СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Физиология морфогенеза базидиомицета Lentinus edodes 7
1.1.1 Общая характеристика базидиомицета Lentinus edodes 7
1.2 Основные стадии развития базидиомицетов 9
1.2.1 Вегетативный мицелий 9
1.2.3 Переход в генеративную фазу и образование КМП 10
1.2.4 Примордий 12
1.2.5 Плодовое тело 14
1.3 Факторы, регулирующие стадии морфогенеза базидиомицетов 15
1.4 Транскриптомное профилирование с помощью 17
высокопроизводительного секвенирования
1.4.1 Высокопроизводительное секвенирование в транскриптомике 17
1.4.2 Подготовка образцов и секвенирование 18
1.4.3 Анализ данных транскриптомного профилирования 20
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 27
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 27
2.1 Описание объекта 27
2.2 Методы исследования 27
2.2.1 Культивирование базидиомицетов 27
2.2.2 Выделение РНК и синтез кДНК-библиотек 27
2.2.3 Высокопроизводительное секвенирование кДНК-библиотек 27
2.2.4 Оценка качества и сортировка ридов 27
2.2.5 Выравнивание ридов на транскрипты L. edodes, дополнительная 28
аннотация, поиск дифференциально экспрессирующихся генов
2.2.6 Классификация ДЭГ по метаболическим путям и 29 функциональным группам, визуализация результатов
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 30
3.1 Подготовка, секвенирование и первичный анализ библиотек кДНК, 30 соответствующих транскриптам генов L. edodes и реконструкция его транскриптома
3.2 Дополнительная аннотация и классификация генов по 32
функциональным категориям
3.3 Выявление генов L. edodes, экспрессирующихся дифференциально 34 на четырех морфогенетических стадиях
3.4 Активируемые/репрессируемые на транскрипционном уровне 38
процессы при чередовании стадий жизненного цикла L. edodes
ВЫВОДЫ 45
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 46
Приложение 1 55
Приложение 2 61
Базидиомицеты - это высшие грибы, которые в ходе онтогенетического развития проходят ряд стадий морфогенеза, начиная от непигментированного мицелия, обеспечивающего эффективное освоение доступного субстрата, и заканчивая формированием плодовых тел, служащих для рассеивания спор. На сегодняшний день, лишь немногочисленные физиологические процессы, которые отличают разные стадии морфогенеза друг от друга, были описаны. При этом глобальное представление о процессах, происходящих в теле гриба при переходе от одной стадии развития к другой, не сформировано. Отсутствие полноценной и обобщенной информации по этому вопросу, во-первых, формирует множество пробелов в понимании фундаментальных основ важного биологического процесса - морфогенеза; во-вторых, это не позволяет полноценно продумать и оптимизировать платформы для культивирования некоторых высших базидиомицетов, представляющих продовольственную ценность. К таким грибам, в частности, относится Lentinula edodes, хорошо известный как гриб шиитаке. Шиитаке высоко ценится за свои вкусовые качества и лечебные свойства; показан его целебный эффект при разнообразных патологиях: от кишечных расстройств до онкологических заболеваний.
Подступиться к проблеме глобального описания физиологии организма становится реальным благодаря методам транскриптомики, основанным на применении высокопроизводительного секвенирования (ВПС). С помощью этих методов возможно оценить уровни экспрессии всех или большинства генов в геноме и сравнить содержание транскриптов при разных состояниях организма. Это, в свою очередь, позволяет нарисовать глобальную картину физиологических изменений, происходящих в организме. Необходимым условием для описания физиологических процессов организма с помощью ВПС является наличие информации о продуктах генов и их классификации по функциональным категориям у исследуемого объекта. Такая информация в настоящее время отсутствует для шиитаке несмотря на то, что геном данного организма уже расшифрован. Решить эту проблему возможно благодаря биоинформатическим подходам, которые позволяют сравнить гены шиитаке с таковыми у хорошо изученных организмов (в том числе, близкородственных) и классифицировать продукты этих генов по функциональным категориям.
В связи с этим целью настоящей работы было сравнение транскриптомных профилей и предсказание физиологических особенностей гриба Lentinula edodes на разных стадиях морфогенеза.
В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Подготовка и секвенирование библиотек кДНК, соответствующих транскриптам генов L. edodes, экспрессирующихся на четырех основных стадиях морфогенеза гриба: непигментированного мицелия, коричневой мицелиальной пленки, примордия и плодового тела;
2. Улучшение аннотации и классификация продуктов генов L. edodes с помощью различных баз данных;
3. Выявление активируемых и репрессируемых категорий генов L. edodes, при прохождении четырех основных стадий морфогенеза.
1. С помощью высокопроизводительного секвенирования проведено
определение нуклеотидных последовательностей библиотек кДНК, соответствующих пулам транскриптов L. edodes четырех основных стадий морфогенеза: непигментированного мицелия, коричневой мицелиальной пленки, примордиев и плодовых тел.
2. С помощью баз данных было проаннотировано 14010 из 14889 генов, при этом 2190 генов L. edodes вошли в 177 функциональных категорий базы данных KEGG.
3. Установлено, что при прохождении четырёх стадий морфогенеза у L. edodes происходит изменение уровней экспрессии 7978 генов, часть из которых входит в 59 функциональных категорий KEGG.
4. На основании результатов транскриптомного профилирования L. edodes был предсказан ряд физиологических особенностей гриба при прохождении четырёх стадий морфогенеза.
