Актуальность проблемы 4
Цель работы 4
Основные задачи исследования 4
Научная новизна 5
Структура и объем диссертации. 5
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 6
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 6
Образцы катетеров, штаммы бактерий 6
Среды и культивирование 6
Идентификация микроорганизмов 6
Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF) 6
Образование биопленок in vitro 7
Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) 7
Сканирующая электронная микроскопия 8
Определение урезанной активности 9
Карбапенемазная активность 9
RT - ПЦР 10
Анализ влияния протеаз на биопленки 11
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 11
Статистический анализ результатов исследований 12
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 13
Идентификация бактериальных биопленок на поверхности катетеров
катетеров методом сканирующей электронной микроскопии 13
Выделение и идентификация микроорганизмов, входящих в состав биопленок на поверхности катетеров 14
Изучение антибиотикорезистентности исследуемого штамма 16
Изучение особенностей формирования биопленок штаммом
P.aeruginosa in vitro 17
Оценка влияния протеаз на модельные биопленки 18
ВЫВОДЫ 20
Актуальность проблемы. Биопленка — это сообщество микроорганизмов, прикрепленных к поверхности или друг к другу, и заключенных в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ [Tetz, 1996]. Формирование биопленок является распространенным явлением для большинства микроорганизмов и характерно как для естественных, так и для антропогенных условий обитания. Наибольшее внимание направлено на биопленки, образуемые на поверхностях медицинских устройств. Ассоциированные с биопленкой микроорганизмы колонизируют широкий спектр медицинских устройств (имплантов, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, контактных линз) и связаны с различными заболеваниями человека. Высокая устойчивость микроорганизмов в составе биопленок к различным антимикробным агентам, в том числе антибиотикам, является одним из патогенетических факторов формирования хронических инфекционных процессов [Dolan et al, 2010].
Катетер-ассоциированные инфекционные заболевания мочевыделительной системы (CAUTI, Catheter-Assotiated Urinary Tract Infections) составляют до 40% всех внутрибольничных заболеваний. В связи с этим, большое внимание исследователей уделяется поиску новых путей борьбы с образованием биопленок, в том числе разрушающих биопленки соединений, которые могут использоваться в качестве эффективных средств комплексной терапии [Septimus et al., 2016]. Формирующей компонентой биопленок является внешний гетерогенный матрикс, образованный полисахаридами, нуклеиновыми кислотами и белками. Таким образом, одним из перспективных путей в борьбе с биопленками является их обработка соединениями, разрушающими структуру матрикса, что сделает клетки бактерий более уязвимыми в отношении антибиотиков.
Цель данной работы: изучить влияние протеаз на биопленки бактерий.
Основные задачи исследования:
1) Визуализация бактериальных биопленок на поверхности катетеров.
2) Выделение, идентификация и изучение спектра антибиотикорезистентности микроорганизмов, входящих в состав биопленок.
3) Изучение особенностей формирования биопленок бактериями in vitro.
4) Оценка влияния различных протеаз на модельные биопленки.
Научная новизна: На сегодняшний день существует множество способов защиты катетеров от образования биопленок - однако эффективность их стремительно снижается в связи с развитыми защитными и адаптационными механизмами самих микроорганизмов, в частности растущая проблема антибиотикорезистентности, обусловленная передачей генов устойчивости среди бактериальных популяций. В связи с этим особенно остро встает проблема поиска новых эффективных средств для борьбы с биопленкообразованием.
В последнее время были достигнуты значительные успехи в поиске различных структурных компонентов матрикса биопленки и идентификации молекул, участвующих в поддержании её целостности и устойчивости. И в ходе этих исследований было выявлено, что существующие данные о роли полисахаридов как основных адгезивных компонентов уже не так актуальны и были найдены новые факты, указывающие на огромную роль белков в качестве важного компонента матрикса биопленки. Эти данные позволяют рассматривать протеазы, в качестве перспективных агентов для борьбы с процессами формирования биопленки, и продолжить их изучение.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 63 страницах машинописного текста, содержит 14 рисунков и 2 таблицы в составе приложений. Цитируемая литература включает 33 источника.
1) Установлено наличие плотных гетерогенных бактериальных биопленок на поверхности катетеров, использованных при лечении урологических больных.
2) Выделены и идентифицированы бактерии, ассоциированные с биопленками на поверхности катетеров (P. aeruginosa, K. oxytoca, E. faecalis. E. Cloacae). Установлена в-лактамазная и уреазная активность штаммов P. aeruginosa и их устойчивость к группам антибиотиков (в-лактамам, пенициллинам, аминогликозидам, цефалоспоринам).
3) Штамм P. aeruginosa 96349 образует биопленки in vitro на среде MH на 5 сутки культивирования.
4) Обработка протеиназой К, трипсином и сериновой протеиназой B. pumilus приводила к диссоциации биопленок P. aeruginosa 96349 в системе in vitro.
