ЯДЕРНЫЙ МАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДОКИНГ В ИССЛЕДОВАНИИ БЕЛОК-ЛИГАНДНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
|
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 8
1.1 Ядерный магнитный резонанс 8
1.2 Основные параметры спектров ЯМР высокого разрешения 13
1.2.1 Химический сдвиг 13
1.2.2 Спин-спиновое взаимодействие 15
1.2.3 Энергетические уровни ядер в магнитном поле 17
1.3 Релаксация 19
1.4 Ядерный Эффект Оверхаузера 23
1.5 Импульсная последовательность
WaterLOGSY .28
1.5.1 Определение константы диссоциации методом WaterLOGSY
спектроскопии 30
1.6 Молекулярный докинг 32
1.6.1 Программный пакет AutoDock 34
2. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
2.1 Сывороточный альбумин 39
2.2 Биологически активные препараты: цефтриаксон, рутин и
м-гидроксибензол 43
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46
3.1 ЯМР спектроскопия. Метод WaterLOGSY 46
3.1.1 Расчет константы диссоциации для комплекса цефтриаксон-
человеческий сывороточный альбумин 48
3.1.2 Расчет константы диссоциации для комплекса рутин - человеческий
сывороточный альбумин 53
3.1.3 Расчет константы диссоциации для комплекса м-гидроксибензол - бычий
сывороточный альбумин 57
3.2 Результаты молекулярного докинга 61
3.2.1 Взаимодействие цефтриаксона с человеческим сывороточным
альбумином 64
3.2.2 Взаимодействие рутина и м-гидроксибензола с человеческим
сывороточным альбумином 68
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 71
ВЫВОДЫ 73
Научная деятельность 74
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 76
1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 8
1.1 Ядерный магнитный резонанс 8
1.2 Основные параметры спектров ЯМР высокого разрешения 13
1.2.1 Химический сдвиг 13
1.2.2 Спин-спиновое взаимодействие 15
1.2.3 Энергетические уровни ядер в магнитном поле 17
1.3 Релаксация 19
1.4 Ядерный Эффект Оверхаузера 23
1.5 Импульсная последовательность
WaterLOGSY .28
1.5.1 Определение константы диссоциации методом WaterLOGSY
спектроскопии 30
1.6 Молекулярный докинг 32
1.6.1 Программный пакет AutoDock 34
2. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
2.1 Сывороточный альбумин 39
2.2 Биологически активные препараты: цефтриаксон, рутин и
м-гидроксибензол 43
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46
3.1 ЯМР спектроскопия. Метод WaterLOGSY 46
3.1.1 Расчет константы диссоциации для комплекса цефтриаксон-
человеческий сывороточный альбумин 48
3.1.2 Расчет константы диссоциации для комплекса рутин - человеческий
сывороточный альбумин 53
3.1.3 Расчет константы диссоциации для комплекса м-гидроксибензол - бычий
сывороточный альбумин 57
3.2 Результаты молекулярного докинга 61
3.2.1 Взаимодействие цефтриаксона с человеческим сывороточным
альбумином 64
3.2.2 Взаимодействие рутина и м-гидроксибензола с человеческим
сывороточным альбумином 68
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 71
ВЫВОДЫ 73
Научная деятельность 74
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 76
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) с каждым годом расширяет свои возможности по изучению структуры и свойств различных соединений. Современные возможности спектроскопии ядерного магнитного резонанса позволяют исследовать взаимодействие с макромолекулами, включая белки и фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты или рибонуклеиновой кислоты [1,2]. В течение последних нескольких лет скрининг ядерного магнитного резонанса приобрел значение в целевых программах для создания лекарств [3,4].
Актуальной научной задачей при дизайне лекарственных препаратов является вопрос изучения особенностей образования белок-лигандных комплексов. Одним из наиболее информативных экспериментальных методов поиска молекулярных фрагментов, связывающихся с биомишенями, является спектроскопия ЯМР [5]. Приложения методов ЯМР можно разделить на две категории. В первой, наблюдение происходит за белком. Записываются ЯМР спектры белка, определяют специфические аминокислотные остатки ответственные за взаимодействие с лигандом, и строится трехмерная модель комплекса [6]. Во второй категории экспериментов ЯМР наблюдение происходит за сигналами лиганда, и по изменению физических параметров ЯМР сигналов лиганда, таких как химического сдвига, времен релаксаций, Ядерного Эффекта Оверхаузера (ЯЭО) судят об образовании белок-лигандного комплекса. В эту категорию попадают такие эксперименты как: Saturation Transfer Difference (STD) [7], Water-Ligand Observed via Gradient SpectroscopY (WaterLOGSY) [8]. Достоинством первого подхода, когда происходит наблюдение за ЯМР сигналами белка, является возможность построения модели комплекса белка с лигандом на основании прямых экспериментальных данных. Недостатком же такого подхода является существенная дороговизна эксперимента требующего достаточно больших количеств изотопно обогащённого белка, с одной стороны и ограничение на молекулярную массу
4
белка, с другой стороны. Методы ЯМР спектроскопии, построенные на наблюдении за сигналами лиганда лишены этих недостатков. Можно использовать существенно меньшие количества белка, нет необходимости в его изотопном обогащении, и нет ограничения по молекулярной массе белка, с которым можно проводить эксперимент. Недостатком такого подхода является то, что эти эксперименты не дают прямой экспериментальной информации о структуре комплекса. Можно сделать оценку энергии образования комплекса, посредством измерения константы диссоциации.
Для компенсации недостатков методов ЯМР основанных на наблюдении сигналов лиганда в качестве дополнительного метода, возможно, применять компьютерное моделирование для построения модели комплекса лиганда с белком [9]. Одним из наиболее быстрых и простых методов компьютерного моделирования является метод молекулярного докинга реализованного в различных программах. Программа Autodock [10] широко используется в комбинации с различными экспериментальными методами и позволяет определять структуру белок-лигандного комплекса и рассчитывать энергию взаимодействия с экспериментальной точностью.
Метод WaterLOGSY и молекулярный докинг являются
комплементарными, универсальными методами для быстрого скрининга и нахождения лигандов взаимодействующих с белком.
При введении в кровь большинство лекарственных соединений образуют комплексы с белками плазмы крови, и их дальнейшая транспортировка по кровеносной системе происходит в составе белок-лигандных комплексов. Одним из наиболее распространенным белком плазмы крови является сывороточный альбумин [11], доля которого составляет около 60% от суммарного количества белков крови. Альбумин вызывает большой интерес фармацевтической промышленности, поскольку он может связывать значительное число лигандов различной химической структуры, таких как биологически активные вещества [12], жирные кислоты [13, 14], неорганические ионы [15], а также лекарственные вещества и их метаболиты [16-19]. Таким образом, при дизайне лекарственных препаратов важно прояснить структуру, функцию и свойства белок-лигандных комплексов.
Перечисленные выше
обстоятельства в совокупности
позволили сформулировать цели и задачи данного исследования.
Цель работы: исследование комплексообразования биологически
активных препаратов с сывороточным альбумином методами ЯМР спектроскопии высокого разрешения и компьютерного моделирования.
В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучение импульсной последовательности WaterLOGSY на примере взаимодействия биологически активных препаратов: цефтриаксона, рутина и м-гидроксибензола с сывороточным альбумином человека и бычьим сывороточным альбумином.
2. Определение константы диссоциации комплекса методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса.
3. Изучение молекулярного докинга с использованием программы AutoDock на примере взаимодействия цефтриаксона, рутина, м-гидроксибензола с человеческим сывороточным альбумином и расчет константы диссоциации лиганда с белком.
4. Анализ и сравнение экспериментальных данных полученных методом спектроскопии ядерного-магнитного резонанса и теоретических результатов, полученных методом молекулярного докинга.
Объектами исследования являются человеческий и бычий сывороточный альбумины, и биологические активные препараты: цефтриаксон, рутин и м- гидроксибензол.
В данной работе методы ЯМР спектроскопии и молекулярного докинга были применены для изучения взаимодействия биологически активных препаратов с сывороточным альбумином человека. Показано преимущество совместного применения метода WaterLOGSY и молекулярного докинга. Методом WaterLOGSY определены константы диссоциации белок-лигандных комплексов, которые были подтверждены расчетами энергии взаимодействия человеческого сывороточного альбумина с лигандами. Кроме того, докинг был применен для определения структуры образованных комплексов и анализа аминокислотных остатков играющих ключевую роль в образовании комплексов.
Работа проводилась на ЯМР спектрометре высокого разрешения «Bruker Avance III 600» фирмы «Bruker» в ЯМР лаборатории биофизической химии наносистем Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.
Актуальной научной задачей при дизайне лекарственных препаратов является вопрос изучения особенностей образования белок-лигандных комплексов. Одним из наиболее информативных экспериментальных методов поиска молекулярных фрагментов, связывающихся с биомишенями, является спектроскопия ЯМР [5]. Приложения методов ЯМР можно разделить на две категории. В первой, наблюдение происходит за белком. Записываются ЯМР спектры белка, определяют специфические аминокислотные остатки ответственные за взаимодействие с лигандом, и строится трехмерная модель комплекса [6]. Во второй категории экспериментов ЯМР наблюдение происходит за сигналами лиганда, и по изменению физических параметров ЯМР сигналов лиганда, таких как химического сдвига, времен релаксаций, Ядерного Эффекта Оверхаузера (ЯЭО) судят об образовании белок-лигандного комплекса. В эту категорию попадают такие эксперименты как: Saturation Transfer Difference (STD) [7], Water-Ligand Observed via Gradient SpectroscopY (WaterLOGSY) [8]. Достоинством первого подхода, когда происходит наблюдение за ЯМР сигналами белка, является возможность построения модели комплекса белка с лигандом на основании прямых экспериментальных данных. Недостатком же такого подхода является существенная дороговизна эксперимента требующего достаточно больших количеств изотопно обогащённого белка, с одной стороны и ограничение на молекулярную массу
4
белка, с другой стороны. Методы ЯМР спектроскопии, построенные на наблюдении за сигналами лиганда лишены этих недостатков. Можно использовать существенно меньшие количества белка, нет необходимости в его изотопном обогащении, и нет ограничения по молекулярной массе белка, с которым можно проводить эксперимент. Недостатком такого подхода является то, что эти эксперименты не дают прямой экспериментальной информации о структуре комплекса. Можно сделать оценку энергии образования комплекса, посредством измерения константы диссоциации.
Для компенсации недостатков методов ЯМР основанных на наблюдении сигналов лиганда в качестве дополнительного метода, возможно, применять компьютерное моделирование для построения модели комплекса лиганда с белком [9]. Одним из наиболее быстрых и простых методов компьютерного моделирования является метод молекулярного докинга реализованного в различных программах. Программа Autodock [10] широко используется в комбинации с различными экспериментальными методами и позволяет определять структуру белок-лигандного комплекса и рассчитывать энергию взаимодействия с экспериментальной точностью.
Метод WaterLOGSY и молекулярный докинг являются
комплементарными, универсальными методами для быстрого скрининга и нахождения лигандов взаимодействующих с белком.
При введении в кровь большинство лекарственных соединений образуют комплексы с белками плазмы крови, и их дальнейшая транспортировка по кровеносной системе происходит в составе белок-лигандных комплексов. Одним из наиболее распространенным белком плазмы крови является сывороточный альбумин [11], доля которого составляет около 60% от суммарного количества белков крови. Альбумин вызывает большой интерес фармацевтической промышленности, поскольку он может связывать значительное число лигандов различной химической структуры, таких как биологически активные вещества [12], жирные кислоты [13, 14], неорганические ионы [15], а также лекарственные вещества и их метаболиты [16-19]. Таким образом, при дизайне лекарственных препаратов важно прояснить структуру, функцию и свойства белок-лигандных комплексов.
Перечисленные выше
обстоятельства в совокупности
позволили сформулировать цели и задачи данного исследования.
Цель работы: исследование комплексообразования биологически
активных препаратов с сывороточным альбумином методами ЯМР спектроскопии высокого разрешения и компьютерного моделирования.
В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучение импульсной последовательности WaterLOGSY на примере взаимодействия биологически активных препаратов: цефтриаксона, рутина и м-гидроксибензола с сывороточным альбумином человека и бычьим сывороточным альбумином.
2. Определение константы диссоциации комплекса методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса.
3. Изучение молекулярного докинга с использованием программы AutoDock на примере взаимодействия цефтриаксона, рутина, м-гидроксибензола с человеческим сывороточным альбумином и расчет константы диссоциации лиганда с белком.
4. Анализ и сравнение экспериментальных данных полученных методом спектроскопии ядерного-магнитного резонанса и теоретических результатов, полученных методом молекулярного докинга.
Объектами исследования являются человеческий и бычий сывороточный альбумины, и биологические активные препараты: цефтриаксон, рутин и м- гидроксибензол.
В данной работе методы ЯМР спектроскопии и молекулярного докинга были применены для изучения взаимодействия биологически активных препаратов с сывороточным альбумином человека. Показано преимущество совместного применения метода WaterLOGSY и молекулярного докинга. Методом WaterLOGSY определены константы диссоциации белок-лигандных комплексов, которые были подтверждены расчетами энергии взаимодействия человеческого сывороточного альбумина с лигандами. Кроме того, докинг был применен для определения структуры образованных комплексов и анализа аминокислотных остатков играющих ключевую роль в образовании комплексов.
Работа проводилась на ЯМР спектрометре высокого разрешения «Bruker Avance III 600» фирмы «Bruker» в ЯМР лаборатории биофизической химии наносистем Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.
1. Экспериментально методом WaterLOGSY показано, что цефтриаксон, рутин и м-гидроксибензол образуют комплексы с сывороточным альбумином. Измерена константа диссоциации для этих комплексов.
2. Молекулярный докинг продемонстрировал, что цефтриаксон, рутин и м- гидроксибензол образуют стабильные комплексы с сывороточным альбумином. Определены аминокислотные остатки сывороточного альбумина, взаимодействующие с лигандами. Предпочтительное место связывания цефтриаксона и рутина с сывороточным альбумином человека идентифицируется как I центр связывания (субдомен IIA). М- гидроксибензол связывается как с I центром связывания, так и со II центром равно вероятно.
3. Энергии образования комплексов по данным метода WaterLOGSY и молекулярного докинга согласуются друг с другом и убывают в ряду цефтриаксон, рутин и м-гидроксибензол.
Научная деятельность
Доклады на конференциях:
1. The study of protein ligand interaction by WaterLOGSY NMR, The international conference “Modem development of magnetic resonance”, Kazan, September 24-28, 2018.
2. ЯМР в исследовании белок-лигандного взаимодействия для разработки терапевтических препаратов, Итоговая научно-образовательная конференция студентов Института Физики, Институт Физики КФУ, 12.04.2019, устный доклад (9-е место).
Публикации:
1. A.G.Danilova. The Study of Protein Ligand Interaction by WaterLOGSY NMR / A.G.Danilova., A.N.Turanov., B.I.Khairutdinov., Yu.F.Zuev. // Abstracts of the international conference “Modern development of magnetic resonance” Editor Salikhov Kev M. - Kazan, 2018: Published by Zavoisky Physical - Technical Institute, FRC Kazan Scientific Center of RAS. P.121
2. Данилова А.Г., Хайрутдинов Б.И. ЯМР в исследовании белок-
лигандного взаимодействия для разработки терапевтических препаратов // Итоговая научно-образовательная конференция студентов Казанского
Федерального Университета 2019 года: сб.тезисов. Казань: Изд-во Казан.Ун-та. (в печати)
3. Данилова А.Г., Хайрутдинов Б.И. ЯМР в исследовании белок-
лигандного взаимодействия для разработки терапевтических препаратов // Итоговая научно-образовательная конференция студентов Казанского
Федерального Университета 2019 года: сб.статей. Казань: Изд-во Казан.Ун-та. (в печати)
2. Молекулярный докинг продемонстрировал, что цефтриаксон, рутин и м- гидроксибензол образуют стабильные комплексы с сывороточным альбумином. Определены аминокислотные остатки сывороточного альбумина, взаимодействующие с лигандами. Предпочтительное место связывания цефтриаксона и рутина с сывороточным альбумином человека идентифицируется как I центр связывания (субдомен IIA). М- гидроксибензол связывается как с I центром связывания, так и со II центром равно вероятно.
3. Энергии образования комплексов по данным метода WaterLOGSY и молекулярного докинга согласуются друг с другом и убывают в ряду цефтриаксон, рутин и м-гидроксибензол.
Научная деятельность
Доклады на конференциях:
1. The study of protein ligand interaction by WaterLOGSY NMR, The international conference “Modem development of magnetic resonance”, Kazan, September 24-28, 2018.
2. ЯМР в исследовании белок-лигандного взаимодействия для разработки терапевтических препаратов, Итоговая научно-образовательная конференция студентов Института Физики, Институт Физики КФУ, 12.04.2019, устный доклад (9-е место).
Публикации:
1. A.G.Danilova. The Study of Protein Ligand Interaction by WaterLOGSY NMR / A.G.Danilova., A.N.Turanov., B.I.Khairutdinov., Yu.F.Zuev. // Abstracts of the international conference “Modern development of magnetic resonance” Editor Salikhov Kev M. - Kazan, 2018: Published by Zavoisky Physical - Technical Institute, FRC Kazan Scientific Center of RAS. P.121
2. Данилова А.Г., Хайрутдинов Б.И. ЯМР в исследовании белок-
лигандного взаимодействия для разработки терапевтических препаратов // Итоговая научно-образовательная конференция студентов Казанского
Федерального Университета 2019 года: сб.тезисов. Казань: Изд-во Казан.Ун-та. (в печати)
3. Данилова А.Г., Хайрутдинов Б.И. ЯМР в исследовании белок-
лигандного взаимодействия для разработки терапевтических препаратов // Итоговая научно-образовательная конференция студентов Казанского
Федерального Университета 2019 года: сб.статей. Казань: Изд-во Казан.Ун-та. (в печати)