Помощь студентам в учебе
Сравнительная ядерная магнитно-резонансная спектроскопия циклоспоринов А и С и влияние одиночной аминокислотной замены
|
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1. ЯМР 6
1.2. ЯМР спектроскопия 8
1.3. История 9
1.4. Компоненты ЯМР спектрометра 9
1.5. Подготовка образцов для эксперимента ЯМР 11
1.6. Основные методы ЯМР 11
1.6.1. Химический сдвиг 11
1.6.2. Спин-спиновое взаимодействие 14
1.6.3. Время релаксации спина 16
1.7. Специальные экспериментальные методы в спектроскопии ядерного
магнитного резонанса 18
1.7.1. Одномерные ЯМР-эксперименты 18
1.7.1.2. Интегрирование 19
1.7.2. Двумерные эксперименты ЯМР 20
1.7.2.1. Корреляционная спектроскопия (COSY) 21
1.7.2.2. Корреляционная спектроскопия TOCSY 23
1.7.2.3. Гетероядерная одноквантовая корреляционная спектроскопия (HSQC) 24
1.7.2.4. Гетероядерная корреляционная спектроскопия через несколько
связей (HMBC) 25
1.7.2.5. Гетероядерная корреляционная спектроскопия (HETCOR) 25
1.7.2.6. Спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY) 26
1.7.2.7. Спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во
вращающейся системе координат (ROESY): 27
1.7.2.8. Сравнение NOESY и ROESY 28
2. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ 30
2.1. Механизм действия циклоспорина 30
2.2. Объект 30
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 32
3.1. Исследование циклоспорина в хлороформе (CDCl3): 32
3.1.1. ЯМР 1H CsC в хлороформе 32
3.1.2. Спектр DQF-COSY CsC 34
3.1.3. HMBC спектр CsC 35
3.1.4. HSQC спектр CsC 36
3.1.5. TOCSY спектр CsC 37
3.1.6. NOESY CsC Спектр 38
3.1.7. Спектр ROESY 39
3.2. Исследование циклоспорина в диметилформамиде (ДМФА) 40
3.2.1. ЯМР 1H CsC в полярной среде (ДМФА) 41
3.2.2. ROESY спектр CsC в ДМФА 43
3.3. Сравнение между CsC и CsA в хлороформе (CDCl3) 45
Заключение и выводы 47
Библиография 50
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1. ЯМР 6
1.2. ЯМР спектроскопия 8
1.3. История 9
1.4. Компоненты ЯМР спектрометра 9
1.5. Подготовка образцов для эксперимента ЯМР 11
1.6. Основные методы ЯМР 11
1.6.1. Химический сдвиг 11
1.6.2. Спин-спиновое взаимодействие 14
1.6.3. Время релаксации спина 16
1.7. Специальные экспериментальные методы в спектроскопии ядерного
магнитного резонанса 18
1.7.1. Одномерные ЯМР-эксперименты 18
1.7.1.2. Интегрирование 19
1.7.2. Двумерные эксперименты ЯМР 20
1.7.2.1. Корреляционная спектроскопия (COSY) 21
1.7.2.2. Корреляционная спектроскопия TOCSY 23
1.7.2.3. Гетероядерная одноквантовая корреляционная спектроскопия (HSQC) 24
1.7.2.4. Гетероядерная корреляционная спектроскопия через несколько
связей (HMBC) 25
1.7.2.5. Гетероядерная корреляционная спектроскопия (HETCOR) 25
1.7.2.6. Спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY) 26
1.7.2.7. Спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во
вращающейся системе координат (ROESY): 27
1.7.2.8. Сравнение NOESY и ROESY 28
2. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ 30
2.1. Механизм действия циклоспорина 30
2.2. Объект 30
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 32
3.1. Исследование циклоспорина в хлороформе (CDCl3): 32
3.1.1. ЯМР 1H CsC в хлороформе 32
3.1.2. Спектр DQF-COSY CsC 34
3.1.3. HMBC спектр CsC 35
3.1.4. HSQC спектр CsC 36
3.1.5. TOCSY спектр CsC 37
3.1.6. NOESY CsC Спектр 38
3.1.7. Спектр ROESY 39
3.2. Исследование циклоспорина в диметилформамиде (ДМФА) 40
3.2.1. ЯМР 1H CsC в полярной среде (ДМФА) 41
3.2.2. ROESY спектр CsC в ДМФА 43
3.3. Сравнение между CsC и CsA в хлороформе (CDCl3) 45
Заключение и выводы 47
Библиография 50
Открытие циклоспорина в 1971 году положило начало новой эре в иммунофармакологии. Это был первый иммуносупрессивный препарат, позволивший селективно осуществлять иммунорегуляцию Т-клеток без чрезмерной токсичности. Циклоспорин выделяли из гриба Tolypocladium inflatum Gams (Рисунок 1) [1] и других грибов или путем направленного биосинтеза или полного химического синтеза.
Рисунок 1 - Грибок Tolypocladium inflatum Еще в 1978 году сообщалось, что иммуносупрессивное действие циклоспорина А эффективно предотвращает отторжение органов и лечение сопутствующих заболеваний. Циклоспорин А в настоящее время широко используется для сдерживания отторжения после трансплантации органов (особенно сердца, легких и почек), а также для профилактики и лечения заболеваний трансплантатов после пересадки костного мозга. Он также используется для лечения многочисленных аутоиммунных заболеваний. Однако сообщалось о многих дополнительных биологических действиях CsA, включая противовоспалительное, паразитарное (антималярийное), противогрибковое и противовирусное (анти-ВИЧ) действия [2]. Препарат подавляет Т-клеточные
иммунозависимые реакции, поскольку ингибирует активацию лимфоцитов, блокируя транскрипцию генов цитокинов для интерлейкинов, в частности IL-4 и IL-2. Разработка эффективной пероральной системы доставки этого препарата осложняется его низкими биофармацевтическими характеристиками (низкая растворимость) и необходимостью тщательного мониторинга его уровня в крови [2].
В работе производится анализ конформационного поведения близкого аналога CsA - циклоспорина C (CsC) в хлороформе и диметилформамиде на основе данных спектроскопии ядерного магнитного резонанса высокого разрешения.
Целью работы являлось сравнительное исследование структур циклоспоринов A и С методами спектроскопии ЯМР и анализ конформационного равновесия CsC в полярной среде (ДМФА). Исходя из указанной цели, можно выделить задачи, поставленные в работе:
1 13
1. Получить одно- и двумерные спектры ЯМР ( Н, С) циклоспорина С в хлороформе (CDCl3) при 298 К, включая спектры DQF-COSY, TOCSY, ROESY, HSQC, HMBC.
2. Получить одно- и двумерные спектры ЯМР (1Н) циклоспорина С в ДМФА при разных температурах (TOCSY, ROESY, NOESY).
3. Произвести соотнесение остатков и сигналов ЯМР по двумерным корреляционным спектрам (гомоядерным и гетероядерным) с помощью ПО TopSpin и Sparky.
4. Обнаружить протоны NH, участвующие в формировании внутримолекулярных водородных связей.
Рисунок 1 - Грибок Tolypocladium inflatum Еще в 1978 году сообщалось, что иммуносупрессивное действие циклоспорина А эффективно предотвращает отторжение органов и лечение сопутствующих заболеваний. Циклоспорин А в настоящее время широко используется для сдерживания отторжения после трансплантации органов (особенно сердца, легких и почек), а также для профилактики и лечения заболеваний трансплантатов после пересадки костного мозга. Он также используется для лечения многочисленных аутоиммунных заболеваний. Однако сообщалось о многих дополнительных биологических действиях CsA, включая противовоспалительное, паразитарное (антималярийное), противогрибковое и противовирусное (анти-ВИЧ) действия [2]. Препарат подавляет Т-клеточные
иммунозависимые реакции, поскольку ингибирует активацию лимфоцитов, блокируя транскрипцию генов цитокинов для интерлейкинов, в частности IL-4 и IL-2. Разработка эффективной пероральной системы доставки этого препарата осложняется его низкими биофармацевтическими характеристиками (низкая растворимость) и необходимостью тщательного мониторинга его уровня в крови [2].
В работе производится анализ конформационного поведения близкого аналога CsA - циклоспорина C (CsC) в хлороформе и диметилформамиде на основе данных спектроскопии ядерного магнитного резонанса высокого разрешения.
Целью работы являлось сравнительное исследование структур циклоспоринов A и С методами спектроскопии ЯМР и анализ конформационного равновесия CsC в полярной среде (ДМФА). Исходя из указанной цели, можно выделить задачи, поставленные в работе:
1 13
1. Получить одно- и двумерные спектры ЯМР ( Н, С) циклоспорина С в хлороформе (CDCl3) при 298 К, включая спектры DQF-COSY, TOCSY, ROESY, HSQC, HMBC.
2. Получить одно- и двумерные спектры ЯМР (1Н) циклоспорина С в ДМФА при разных температурах (TOCSY, ROESY, NOESY).
3. Произвести соотнесение остатков и сигналов ЯМР по двумерным корреляционным спектрам (гомоядерным и гетероядерным) с помощью ПО TopSpin и Sparky.
4. Обнаружить протоны NH, участвующие в формировании внутримолекулярных водородных связей.
ЯМР-спектр - это качественный инструмент, широко используемый в фармацевтической, химической промышленности для структурного исследования лекарственных средств, химических веществ и т.д. Сочетание различных гомо- и гетероядерных двумерных ЯМР-экспериментов позволило соотнести все H- и C-резонансы циклоспорина C.
Как только становится ясно, какие спиновые системы являются последовательными по сегменту из 3-4 остатков, дополнительной информации из идентификации спиновой системы обычно достаточно, чтобы назначить спиновые системы их точному положению в аминокислотной последовательности.
Рисунок 15 - Структура циклоспоринов A, C, D, G и H. Боковые цепи: NorVal -CH2CH2CH3, Thr -CH(OH)CH3, Val -CH(CH3)2, Abu (L-аминомасляная кислота) -CH2CH3. Пунктирные линии представляют водородные связи [24].
Проведенные исследования и результаты, полученные в настоящей работе, предоставляют много возможностей для дальнейших исследований. Основными подходами для будущих исследований в этой области может быть проведение исследований на большем количестве образцов из семейства циклоспоринов, чтобы прояснить взаимосвязь между структурной формулой соединения и его активностью. Отдалённой целью является поиск наиболее эффективного варианта иммунодепрессанта с минимально возможной токсичностью.
Целью данной работы было изучение конформационного поведения циклоспорина С в различных растворителях, один из которых является неполярным (CDCI3), а другой - полярным (ДМФА) с использованием методов ЯМР высокого разрешения. Это было достигнуто с помощью спектроскопии ЯМР циклоспорина С при различных температурах путем в обоих растворителях и последующей обработки спектров ЯМР. Полученные данные могут быть в дальнейшем использованы в исследованиях, проводимых в лаборатории ЯМР.
Основные результаты:
1) Получены одно- и двумерные спектры ЯМР (1Н, 13С) циклоспорина С в хлороформе (CDCl3) при 298 К, включая спектры DQF-COSY, TOCSY, ROESY, HSQC, HMBC. Соотнесение остатков сигнала произведено по двумерным корреляционным спектрам с помощью ПО TopSpin и Sparky. Результаты соотнесения представлены в базе данных BMRB под номером 27800.
2) Получены одно- и двумерные спектров ЯМР (1Н) циклоспорина С в ДМФА при разных температурах (TOCSY, ROESY, NOESY). По спектрам ROESY наблюдался медленный конформационный обмен.
3) Соотнесение сигналов ЯМР CsC в сравнении с CsA показало небольшое отличие химсдвигов в отдельных аминокислотах, что можно объяснить как локальное изменение конфигурации основной цепи. В целом можно ожидать, что структуры молекул близки.
4) Спектры ROESY CsC в ДМФА позволили сделать частичное соотнесение NH-сигналов. Все остатки с NH-группами (Ala, Val, Thr) дают по несколько сигналов, что подтверждает идею о существовании в равновесии различных конформаций.
5) По зависимости химсдвига от температуры обнаружены протоны NH, участвующие во внутримолекулярных водородных связях, и те, которые подвергаются воздействию растворителя. Доля конформеров с сохранёнными внутримолекулярными H-связями при растворении в ДМФА невелика, <15%.
По результатам исследования подготовлен доклад на 16 Международной школе-конференции «Spinus 2019», а также написана статья в рецензируемом научном журнале BioNanoScience [26, 27].
Как только становится ясно, какие спиновые системы являются последовательными по сегменту из 3-4 остатков, дополнительной информации из идентификации спиновой системы обычно достаточно, чтобы назначить спиновые системы их точному положению в аминокислотной последовательности.
Рисунок 15 - Структура циклоспоринов A, C, D, G и H. Боковые цепи: NorVal -CH2CH2CH3, Thr -CH(OH)CH3, Val -CH(CH3)2, Abu (L-аминомасляная кислота) -CH2CH3. Пунктирные линии представляют водородные связи [24].
Проведенные исследования и результаты, полученные в настоящей работе, предоставляют много возможностей для дальнейших исследований. Основными подходами для будущих исследований в этой области может быть проведение исследований на большем количестве образцов из семейства циклоспоринов, чтобы прояснить взаимосвязь между структурной формулой соединения и его активностью. Отдалённой целью является поиск наиболее эффективного варианта иммунодепрессанта с минимально возможной токсичностью.
Целью данной работы было изучение конформационного поведения циклоспорина С в различных растворителях, один из которых является неполярным (CDCI3), а другой - полярным (ДМФА) с использованием методов ЯМР высокого разрешения. Это было достигнуто с помощью спектроскопии ЯМР циклоспорина С при различных температурах путем в обоих растворителях и последующей обработки спектров ЯМР. Полученные данные могут быть в дальнейшем использованы в исследованиях, проводимых в лаборатории ЯМР.
Основные результаты:
1) Получены одно- и двумерные спектры ЯМР (1Н, 13С) циклоспорина С в хлороформе (CDCl3) при 298 К, включая спектры DQF-COSY, TOCSY, ROESY, HSQC, HMBC. Соотнесение остатков сигнала произведено по двумерным корреляционным спектрам с помощью ПО TopSpin и Sparky. Результаты соотнесения представлены в базе данных BMRB под номером 27800.
2) Получены одно- и двумерные спектров ЯМР (1Н) циклоспорина С в ДМФА при разных температурах (TOCSY, ROESY, NOESY). По спектрам ROESY наблюдался медленный конформационный обмен.
3) Соотнесение сигналов ЯМР CsC в сравнении с CsA показало небольшое отличие химсдвигов в отдельных аминокислотах, что можно объяснить как локальное изменение конфигурации основной цепи. В целом можно ожидать, что структуры молекул близки.
4) Спектры ROESY CsC в ДМФА позволили сделать частичное соотнесение NH-сигналов. Все остатки с NH-группами (Ala, Val, Thr) дают по несколько сигналов, что подтверждает идею о существовании в равновесии различных конформаций.
5) По зависимости химсдвига от температуры обнаружены протоны NH, участвующие во внутримолекулярных водородных связях, и те, которые подвергаются воздействию растворителя. Доля конформеров с сохранёнными внутримолекулярными H-связями при растворении в ДМФА невелика, <15%.
По результатам исследования подготовлен доклад на 16 Международной школе-конференции «Spinus 2019», а также написана статья в рецензируемом научном журнале BioNanoScience [26, 27].