Открытие циклоспорина в 1971 году положило начало новой эре в иммунофармакологии. Это был первый иммуносупрессивный препарат, позволивший селективно осуществлять иммунорегуляцию Т-клеток без чрезмерной токсичности. Циклоспорин выделяли из гриба Tolypocladium inflatum Gams (Рисунок 1) [1] и других грибов или путем направленного биосинтеза или полного химического синтеза.
Рисунок 1 - Грибок Tolypocladium inflatum Еще в 1978 году сообщалось, что иммуносупрессивное действие циклоспорина А эффективно предотвращает отторжение органов и лечение сопутствующих заболеваний. Циклоспорин А в настоящее время широко используется для сдерживания отторжения после трансплантации органов (особенно сердца, легких и почек), а также для профилактики и лечения заболеваний трансплантатов после пересадки костного мозга. Он также используется для лечения многочисленных аутоиммунных заболеваний. Однако сообщалось о многих дополнительных биологических действиях CsA, включая противовоспалительное, паразитарное (антималярийное), противогрибковое и противовирусное (анти-ВИЧ) действия [2]. Препарат подавляет Т-клеточные
иммунозависимые реакции, поскольку ингибирует активацию лимфоцитов, блокируя транскрипцию генов цитокинов для интерлейкинов, в частности IL-4 и IL-2. Разработка эффективной пероральной системы доставки этого препарата осложняется его низкими биофармацевтическими характеристиками (низкая растворимость) и необходимостью тщательного мониторинга его уровня в крови [2].
В работе производится анализ конформационного поведения близкого аналога CsA - циклоспорина C (CsC) в хлороформе и диметилформамиде на основе данных спектроскопии ядерного магнитного резонанса высокого разрешения.
Целью работы являлось сравнительное исследование структур циклоспоринов A и С методами спектроскопии ЯМР и анализ конформационного равновесия CsC в полярной среде (ДМФА). Исходя из указанной цели, можно выделить задачи, поставленные в работе:
1 13
1. Получить одно- и двумерные спектры ЯМР ( Н, С) циклоспорина С в хлороформе (CDCl3) при 298 К, включая спектры DQF-COSY, TOCSY, ROESY, HSQC, HMBC.
2. Получить одно- и двумерные спектры ЯМР (1Н) циклоспорина С в ДМФА при разных температурах (TOCSY, ROESY, NOESY).
3. Произвести соотнесение остатков и сигналов ЯМР по двумерным корреляционным спектрам (гомоядерным и гетероядерным) с помощью ПО TopSpin и Sparky.
4. Обнаружить протоны NH, участвующие в формировании внутримолекулярных водородных связей.
ЯМР-спектр - это качественный инструмент, широко используемый в фармацевтической, химической промышленности для структурного исследования лекарственных средств, химических веществ и т.д. Сочетание различных гомо- и гетероядерных двумерных ЯМР-экспериментов позволило соотнести все H- и C-резонансы циклоспорина C.
Как только становится ясно, какие спиновые системы являются последовательными по сегменту из 3-4 остатков, дополнительной информации из идентификации спиновой системы обычно достаточно, чтобы назначить спиновые системы их точному положению в аминокислотной последовательности.
Рисунок 15 - Структура циклоспоринов A, C, D, G и H. Боковые цепи: NorVal -CH2CH2CH3, Thr -CH(OH)CH3, Val -CH(CH3)2, Abu (L-аминомасляная кислота) -CH2CH3. Пунктирные линии представляют водородные связи [24].
Проведенные исследования и результаты, полученные в настоящей работе, предоставляют много возможностей для дальнейших исследований. Основными подходами для будущих исследований в этой области может быть проведение исследований на большем количестве образцов из семейства циклоспоринов, чтобы прояснить взаимосвязь между структурной формулой соединения и его активностью. Отдалённой целью является поиск наиболее эффективного варианта иммунодепрессанта с минимально возможной токсичностью.
Целью данной работы было изучение конформационного поведения циклоспорина С в различных растворителях, один из которых является неполярным (CDCI3), а другой - полярным (ДМФА) с использованием методов ЯМР высокого разрешения. Это было достигнуто с помощью спектроскопии ЯМР циклоспорина С при различных температурах путем в обоих растворителях и последующей обработки спектров ЯМР. Полученные данные могут быть в дальнейшем использованы в исследованиях, проводимых в лаборатории ЯМР.
Основные результаты:
1) Получены одно- и двумерные спектры ЯМР (1Н, 13С) циклоспорина С в хлороформе (CDCl3) при 298 К, включая спектры DQF-COSY, TOCSY, ROESY, HSQC, HMBC. Соотнесение остатков сигнала произведено по двумерным корреляционным спектрам с помощью ПО TopSpin и Sparky. Результаты соотнесения представлены в базе данных BMRB под номером 27800.
2) Получены одно- и двумерные спектров ЯМР (1Н) циклоспорина С в ДМФА при разных температурах (TOCSY, ROESY, NOESY). По спектрам ROESY наблюдался медленный конформационный обмен.
3) Соотнесение сигналов ЯМР CsC в сравнении с CsA показало небольшое отличие химсдвигов в отдельных аминокислотах, что можно объяснить как локальное изменение конфигурации основной цепи. В целом можно ожидать, что структуры молекул близки.
4) Спектры ROESY CsC в ДМФА позволили сделать частичное соотнесение NH-сигналов. Все остатки с NH-группами (Ala, Val, Thr) дают по несколько сигналов, что подтверждает идею о существовании в равновесии различных конформаций.
5) По зависимости химсдвига от температуры обнаружены протоны NH, участвующие во внутримолекулярных водородных связях, и те, которые подвергаются воздействию растворителя. Доля конформеров с сохранёнными внутримолекулярными H-связями при растворении в ДМФА невелика, <15%.
По результатам исследования подготовлен доклад на 16 Международной школе-конференции «Spinus 2019», а также написана статья в рецензируемом научном журнале BioNanoScience [26, 27].
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
