Помощь студентам в учебе
СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ С-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА БЕЛКА HPF БАКТЕРИИИ STAPHYLOCOCCUS AUREUS МЕТОДАМИ СПЕКТРОСКОПИИ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ
|
Введение 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Staphylococcus aureus 7
1.2 Фактор гибернации SaHPF из S.aureus 8
1.3 Структура фактора HPF из E.Coli 10
1.4 Структура SaHPF предсказанная с помощью биоинформатических методов 13
1.5 Протокол выделения и очистки белка 15
1.6 Основы спектроскопии ЯМР 17
1.7 Многомерные эксперименты спектроскопии ЯМР 20
1.7.1 Эксперимент HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation spectroscopy) 22
1.7.2 HNCO и HNCA 23
1.7.3 Эксперимент HNCO 24
1.7.4 Эксперимент HNCA 25
1.7.5 Эксперимент HN(CO)CA 26
1.7.6 Эксперимент CBCANH 28
1.7.7 Эксперимент CBCA(CO)NH 29
1.8 Спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) 31
1.8.1 Ошибки в измерении межпротонных расстояний 35
1.8.2 Эксперименты 15N-1H NOESY HSQC и 13C-1H NOESY HSQC 37
1.8.3 13C-1H NOESY HSQC 38
1.8.4 Минимизация энергии и имитация отжига 39
1.8.5 Минимизация энергии 40
1.8.6 Имитация отжига 40
2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦА БЕЛКА ДЛЯ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР 43
2.1 Приготовление образцов для спектроскопии ЯМР 43
2.3 Очистка белка SaHPF на колонке со смолой Ni-NTA Superflow 44
2.4 Осаждение белка в растворе 45
2.5 Конечная стадия очистки белка SaHPF на гель-фильтрационной колонке Superdex
75 10/300 45
2.6 Электрофорез белка 45
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 48
3.1 Эксперименты 15N-1H HSQC 49
3.2 Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 50
Заключение 56
Библиографический список
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Staphylococcus aureus 7
1.2 Фактор гибернации SaHPF из S.aureus 8
1.3 Структура фактора HPF из E.Coli 10
1.4 Структура SaHPF предсказанная с помощью биоинформатических методов 13
1.5 Протокол выделения и очистки белка 15
1.6 Основы спектроскопии ЯМР 17
1.7 Многомерные эксперименты спектроскопии ЯМР 20
1.7.1 Эксперимент HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation spectroscopy) 22
1.7.2 HNCO и HNCA 23
1.7.3 Эксперимент HNCO 24
1.7.4 Эксперимент HNCA 25
1.7.5 Эксперимент HN(CO)CA 26
1.7.6 Эксперимент CBCANH 28
1.7.7 Эксперимент CBCA(CO)NH 29
1.8 Спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) 31
1.8.1 Ошибки в измерении межпротонных расстояний 35
1.8.2 Эксперименты 15N-1H NOESY HSQC и 13C-1H NOESY HSQC 37
1.8.3 13C-1H NOESY HSQC 38
1.8.4 Минимизация энергии и имитация отжига 39
1.8.5 Минимизация энергии 40
1.8.6 Имитация отжига 40
2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦА БЕЛКА ДЛЯ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР 43
2.1 Приготовление образцов для спектроскопии ЯМР 43
2.3 Очистка белка SaHPF на колонке со смолой Ni-NTA Superflow 44
2.4 Осаждение белка в растворе 45
2.5 Конечная стадия очистки белка SaHPF на гель-фильтрационной колонке Superdex
75 10/300 45
2.6 Электрофорез белка 45
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 48
3.1 Эксперименты 15N-1H HSQC 49
3.2 Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 50
Заключение 56
Библиографический список
В 1881 году, в микробиологии появился термин “staphylococcus”, описывающий определенный вид бактерии. Кокки или kokkos (с греч. "Зернышко") - представляют собой бактерии, округлой или немного вытянутой формы. В мире существует множество самых разнообразных кокков, которые сосуществуют в организме человека в течение всей его жизни, но, наиболее известный большинству микроб - это стафилококк. Большинство стафилококков окрашены в фиолетовый цвет и, рассматривая их под микроскопом видно, что кокки собираются в группы, напоминая собой гроздь винограда, в связи с чем они и получили свое название, staphylos (по-гречески "гроздь").
Стафилококки - положительные неподвижные микроорганизмы, в определенном количестве находящиеся на поверхности тела человека (в носо- и ротоглотке, на коже). На данный момент обнаружено 27 видов, из которых 14 постоянно присутствуют на кожных покровах и слизистых человека. Несмотря на то, что большинство стафилококков являются почти безвредными для человека: стоит запомнить, что из тех 14 видов, существуют 3 вида имеющих генетический фактор патогенности, способные привести к развитию инфекционных процессов.
К представителям провоцирующих воспалительные процессы различной локализации относятся: золотистый стафилококк
(S.aureus), эпидермальный стафилококк (S.epidermidis), сапрофитный
стафилококк (S. saprophyticus). В данной работе объектом исследования являлся золотистый стафилококк, наиболее опасный и живучий высоковирулентный вид болезнетворных кокков.
Стафилококковая инфекция - в клинической практике обобщенное
название ряда заболеваний, вызванные стафилококком (на данный момент их
более сотни). Благодаря высокой устойчивости к антибиотикам штаммов
патогенного возбудителя, стафилококковые инфекции находятся в первых
рядах инфекционных заболеваний, носящих гнойно -воспалительный
4
характер. Выделяя экзотоксины и особые вещества, стафилококк подавляет иммунные механизмы организма, становясь причиной воспаления органов и тканей. Поражая ткани кожи, стафилококк проявляется в виде гнойничковых поражений, фурункулов, пиодермии, флегмон и абсцессов. При поражении внутренних органов, лёгких или мозга, стафилококк вызывает ангину, менингит, пневмонию, в случае массивных и тяжелых поражений, имея устойчивость к терапии, часто приводит к абсцессу, сепсису и летальному исходу. Основная роль возникновения отравления принадлежит энтеротоксину продуцируемому стафилококком, имеющий антигенные свойства. Попадая в продукты питания S.aureus образовывает токсин, приводящий к острым пищевым токсикоинфекциям, гастроэнтеритам и воспалениям тонкой и толстой кишки.
Для получения трехмерных структур макромолекул белков и нуклеиновых кислот, применяют различные методы, к ним относят сверхбыструю лазерную спектроскопию, ЯМР-спектроскопию, рентгеноструктурный анализ и криоэлектронную микроскопию. Данные методы используются в структурной биологии, для понимания строения и функционирования живых систем на молекулярном уровне.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения - это метод исследования, состоящий из разнообразных экспериментов (импульсных последовательностей), предназначенных для получения определенной конкретной информации, помогающей определить динамику и строение органических соединений в растворе. Данные используются как в медицинской физике, так и в структурной биологии и органической химии [1]. Например, используя спектроскопию ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY), определяются межпротонные расстояния между магнитными ядрами исследуемой молекулы [2].
Целью данной работы является определение пространственной структуры С-концевого домена белка SaHPF методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения.
Для достижения указанной цели необходимо выполнение следующих задач:
1) Разработка протокола выделения и очистки белка, меченного по изотопам 13C, 15N для структурных исследований методом спектроскопии ЯМР.
2) Регистрация многомерных спектров ЯМР по ядрам 1H, 13C, 15N.
3) Анализ экспериментальных данных ЯМР, отнесение сигналов в спектрах к соответствующим магнитным ядрам молекулы белка.
4) Расчет пространственной структуры белка на основе экспериментальных данных ЯМР методом молекулярной динамики.
Обнаруженная в стационарной фазе рибосома золотистого стафилококка, обладает особенной функцией, которая замедляет белковый синтез, при воздействии на бактериальную клетку стрессовых условий. При взаимодействии рибосомы с белком образуется трансляционно не активный 100S димер рибосом. Благодаря устойчивости к неблагоприятным внешним условиям, клетки обеспечивают резистентность к антимикробным агентам. Актуальность исследования заключается в получении неизвестной, на данный момент, структуры данного белка, которая послужит основой для дальнейших исследований медико-биологических задач.
Стафилококки - положительные неподвижные микроорганизмы, в определенном количестве находящиеся на поверхности тела человека (в носо- и ротоглотке, на коже). На данный момент обнаружено 27 видов, из которых 14 постоянно присутствуют на кожных покровах и слизистых человека. Несмотря на то, что большинство стафилококков являются почти безвредными для человека: стоит запомнить, что из тех 14 видов, существуют 3 вида имеющих генетический фактор патогенности, способные привести к развитию инфекционных процессов.
К представителям провоцирующих воспалительные процессы различной локализации относятся: золотистый стафилококк
(S.aureus), эпидермальный стафилококк (S.epidermidis), сапрофитный
стафилококк (S. saprophyticus). В данной работе объектом исследования являлся золотистый стафилококк, наиболее опасный и живучий высоковирулентный вид болезнетворных кокков.
Стафилококковая инфекция - в клинической практике обобщенное
название ряда заболеваний, вызванные стафилококком (на данный момент их
более сотни). Благодаря высокой устойчивости к антибиотикам штаммов
патогенного возбудителя, стафилококковые инфекции находятся в первых
рядах инфекционных заболеваний, носящих гнойно -воспалительный
4
характер. Выделяя экзотоксины и особые вещества, стафилококк подавляет иммунные механизмы организма, становясь причиной воспаления органов и тканей. Поражая ткани кожи, стафилококк проявляется в виде гнойничковых поражений, фурункулов, пиодермии, флегмон и абсцессов. При поражении внутренних органов, лёгких или мозга, стафилококк вызывает ангину, менингит, пневмонию, в случае массивных и тяжелых поражений, имея устойчивость к терапии, часто приводит к абсцессу, сепсису и летальному исходу. Основная роль возникновения отравления принадлежит энтеротоксину продуцируемому стафилококком, имеющий антигенные свойства. Попадая в продукты питания S.aureus образовывает токсин, приводящий к острым пищевым токсикоинфекциям, гастроэнтеритам и воспалениям тонкой и толстой кишки.
Для получения трехмерных структур макромолекул белков и нуклеиновых кислот, применяют различные методы, к ним относят сверхбыструю лазерную спектроскопию, ЯМР-спектроскопию, рентгеноструктурный анализ и криоэлектронную микроскопию. Данные методы используются в структурной биологии, для понимания строения и функционирования живых систем на молекулярном уровне.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения - это метод исследования, состоящий из разнообразных экспериментов (импульсных последовательностей), предназначенных для получения определенной конкретной информации, помогающей определить динамику и строение органических соединений в растворе. Данные используются как в медицинской физике, так и в структурной биологии и органической химии [1]. Например, используя спектроскопию ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY), определяются межпротонные расстояния между магнитными ядрами исследуемой молекулы [2].
Целью данной работы является определение пространственной структуры С-концевого домена белка SaHPF методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения.
Для достижения указанной цели необходимо выполнение следующих задач:
1) Разработка протокола выделения и очистки белка, меченного по изотопам 13C, 15N для структурных исследований методом спектроскопии ЯМР.
2) Регистрация многомерных спектров ЯМР по ядрам 1H, 13C, 15N.
3) Анализ экспериментальных данных ЯМР, отнесение сигналов в спектрах к соответствующим магнитным ядрам молекулы белка.
4) Расчет пространственной структуры белка на основе экспериментальных данных ЯМР методом молекулярной динамики.
Обнаруженная в стационарной фазе рибосома золотистого стафилококка, обладает особенной функцией, которая замедляет белковый синтез, при воздействии на бактериальную клетку стрессовых условий. При взаимодействии рибосомы с белком образуется трансляционно не активный 100S димер рибосом. Благодаря устойчивости к неблагоприятным внешним условиям, клетки обеспечивают резистентность к антимикробным агентам. Актуальность исследования заключается в получении неизвестной, на данный момент, структуры данного белка, которая послужит основой для дальнейших исследований медико-биологических задач.
В результате проделанной работы были получены следующие
результаты:
-Найдены подходящие условия экспрессии белка для исследования методом
спектроскопии ЯМР.
-Спектры, полученные в ходе работы, были обработаны и проведено
отнесение сигналов ЯМР ядер 1H, 13С и 15N аминокислотных остатков из
основной белковой цепи С-домена белка SaHPF. Показано, что в структуре
С-домена белка в растворе присутствуют элементы вторичной структуры в
виде β-складки: β1 (133-135 остаток), β2 (160-164 остаток), β3 (171-175
остаток), β4 (182-187 остаток) и α-спирали (146-156 остаток).
- На основе полученных данных о химических сдвигах, данных 2D 1H-1H
NOESY спектра, 3D 15N NOESY-HSQC (время смешивания 150 мс) и 13C
NOESY-HSQC (время смешивания 200 мс) спектров ЯМР для белка SaHPFСTD меченного по изотопам 15N и 13C/15N, была получена информация о
межъядерных ЯЭО контактах, двугранных углах, и водородных связях и
рассчитана структура белка методом молекулярной динамики.
- Показано, что структура C-концевого домена белка SaHPF состоит из
одной α-спирали и четырех β-листов (топология β1-α1-β2-β3-β4), а также, что
С-концевой домен белка SaHPF присутствует в растворе в виде гомодимера.
результаты:
-Найдены подходящие условия экспрессии белка для исследования методом
спектроскопии ЯМР.
-Спектры, полученные в ходе работы, были обработаны и проведено
отнесение сигналов ЯМР ядер 1H, 13С и 15N аминокислотных остатков из
основной белковой цепи С-домена белка SaHPF. Показано, что в структуре
С-домена белка в растворе присутствуют элементы вторичной структуры в
виде β-складки: β1 (133-135 остаток), β2 (160-164 остаток), β3 (171-175
остаток), β4 (182-187 остаток) и α-спирали (146-156 остаток).
- На основе полученных данных о химических сдвигах, данных 2D 1H-1H
NOESY спектра, 3D 15N NOESY-HSQC (время смешивания 150 мс) и 13C
NOESY-HSQC (время смешивания 200 мс) спектров ЯМР для белка SaHPFСTD меченного по изотопам 15N и 13C/15N, была получена информация о
межъядерных ЯЭО контактах, двугранных углах, и водородных связях и
рассчитана структура белка методом молекулярной динамики.
- Показано, что структура C-концевого домена белка SaHPF состоит из
одной α-спирали и четырех β-листов (топология β1-α1-β2-β3-β4), а также, что
С-концевой домен белка SaHPF присутствует в растворе в виде гомодимера.