В 1881 году, в микробиологии появился термин “staphylococcus”, описывающий определенный вид бактерии. Кокки или kokkos (с греч. "Зернышко") - представляют собой бактерии, округлой или немного вытянутой формы. В мире существует множество самых разнообразных кокков, которые сосуществуют в организме человека в течение всей его жизни, но, наиболее известный большинству микроб - это стафилококк. Большинство стафилококков окрашены в фиолетовый цвет и, рассматривая их под микроскопом видно, что кокки собираются в группы, напоминая собой гроздь винограда, в связи с чем они и получили свое название, staphylos (по-гречески "гроздь").
Стафилококки - положительные неподвижные микроорганизмы, в определенном количестве находящиеся на поверхности тела человека (в носо- и ротоглотке, на коже). На данный момент обнаружено 27 видов, из которых 14 постоянно присутствуют на кожных покровах и слизистых человека. Несмотря на то, что большинство стафилококков являются почти безвредными для человека: стоит запомнить, что из тех 14 видов, существуют 3 вида имеющих генетический фактор патогенности, способные привести к развитию инфекционных процессов.
К представителям провоцирующих воспалительные процессы различной локализации относятся: золотистый стафилококк
(S.aureus), эпидермальный стафилококк (S.epidermidis), сапрофитный
стафилококк (S. saprophyticus). В данной работе объектом исследования являлся золотистый стафилококк, наиболее опасный и живучий высоковирулентный вид болезнетворных кокков.
Стафилококковая инфекция - в клинической практике обобщенное
название ряда заболеваний, вызванные стафилококком (на данный момент их
более сотни). Благодаря высокой устойчивости к антибиотикам штаммов
патогенного возбудителя, стафилококковые инфекции находятся в первых
рядах инфекционных заболеваний, носящих гнойно -воспалительный
4
характер. Выделяя экзотоксины и особые вещества, стафилококк подавляет иммунные механизмы организма, становясь причиной воспаления органов и тканей. Поражая ткани кожи, стафилококк проявляется в виде гнойничковых поражений, фурункулов, пиодермии, флегмон и абсцессов. При поражении внутренних органов, лёгких или мозга, стафилококк вызывает ангину, менингит, пневмонию, в случае массивных и тяжелых поражений, имея устойчивость к терапии, часто приводит к абсцессу, сепсису и летальному исходу. Основная роль возникновения отравления принадлежит энтеротоксину продуцируемому стафилококком, имеющий антигенные свойства. Попадая в продукты питания S.aureus образовывает токсин, приводящий к острым пищевым токсикоинфекциям, гастроэнтеритам и воспалениям тонкой и толстой кишки.
Для получения трехмерных структур макромолекул белков и нуклеиновых кислот, применяют различные методы, к ним относят сверхбыструю лазерную спектроскопию, ЯМР-спектроскопию, рентгеноструктурный анализ и криоэлектронную микроскопию. Данные методы используются в структурной биологии, для понимания строения и функционирования живых систем на молекулярном уровне.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения - это метод исследования, состоящий из разнообразных экспериментов (импульсных последовательностей), предназначенных для получения определенной конкретной информации, помогающей определить динамику и строение органических соединений в растворе. Данные используются как в медицинской физике, так и в структурной биологии и органической химии [1]. Например, используя спектроскопию ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY), определяются межпротонные расстояния между магнитными ядрами исследуемой молекулы [2].
Целью данной работы является определение пространственной структуры С-концевого домена белка SaHPF методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения.
Для достижения указанной цели необходимо выполнение следующих задач:
1) Разработка протокола выделения и очистки белка, меченного по изотопам 13C, 15N для структурных исследований методом спектроскопии ЯМР.
2) Регистрация многомерных спектров ЯМР по ядрам 1H, 13C, 15N.
3) Анализ экспериментальных данных ЯМР, отнесение сигналов в спектрах к соответствующим магнитным ядрам молекулы белка.
4) Расчет пространственной структуры белка на основе экспериментальных данных ЯМР методом молекулярной динамики.
Обнаруженная в стационарной фазе рибосома золотистого стафилококка, обладает особенной функцией, которая замедляет белковый синтез, при воздействии на бактериальную клетку стрессовых условий. При взаимодействии рибосомы с белком образуется трансляционно не активный 100S димер рибосом. Благодаря устойчивости к неблагоприятным внешним условиям, клетки обеспечивают резистентность к антимикробным агентам. Актуальность исследования заключается в получении неизвестной, на данный момент, структуры данного белка, которая послужит основой для дальнейших исследований медико-биологических задач.
В результате проделанной работы были получены следующие
результаты:
-Найдены подходящие условия экспрессии белка для исследования методом
спектроскопии ЯМР.
-Спектры, полученные в ходе работы, были обработаны и проведено
отнесение сигналов ЯМР ядер 1H, 13С и 15N аминокислотных остатков из
основной белковой цепи С-домена белка SaHPF. Показано, что в структуре
С-домена белка в растворе присутствуют элементы вторичной структуры в
виде β-складки: β1 (133-135 остаток), β2 (160-164 остаток), β3 (171-175
остаток), β4 (182-187 остаток) и α-спирали (146-156 остаток).
- На основе полученных данных о химических сдвигах, данных 2D 1H-1H
NOESY спектра, 3D 15N NOESY-HSQC (время смешивания 150 мс) и 13C
NOESY-HSQC (время смешивания 200 мс) спектров ЯМР для белка SaHPFСTD меченного по изотопам 15N и 13C/15N, была получена информация о
межъядерных ЯЭО контактах, двугранных углах, и водородных связях и
рассчитана структура белка методом молекулярной динамики.
- Показано, что структура C-концевого домена белка SaHPF состоит из
одной α-спирали и четырех β-листов (топология β1-α1-β2-β3-β4), а также, что
С-концевой домен белка SaHPF присутствует в растворе в виде гомодимера.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
