ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЦЕЛЕВЫХ БЕЛКОВ С ПОЛИСАХАРИДАМИ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СИСТЕМ ИНКАПСУЛИРОВАНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ»
|
ВВЕДЕНИЕ 4
1 Обзор литературы 8
1.1 Инкапсулирование лекарственных препаратов 8
1.2 Полисахариды 18
1.2.1 Альгинат натрия 18
1.2.2 к-Каррагинан 20
1.2.3 Рамногалактуронан I 22
1.3 РНКаза Bacillus intermedius (биназа) 24
1.4 Физические методы исследования 26
1.4.1 ИК-спектроскопия 26
1.4.2 ЯМР-спектроскопия 27
1.4.3 Двумерная спектроскопия ЯМР 29
1.4.3.1 Общие принципы 29
1.4.3.2 Гомоядерный COSY спектр 31
1.4.3.3 Гомоядерный двумерный TOCSY спектр 32
1.4.3.4 Ядерная спектроскопия с эффектом Оверхаузера 33
1.5 Методы компьтерного моделировани 35
1.5.1 Молекулярный докинг 35
1.5.1.1 AutoDock 37
1.5.1.2 HADDOCK 37
1.5.2 Молекулярная динамика 38
2 Материалы и методы 39
2.1 Материалы 39
2.2 ИК-спектроскопия 39
2.3 ЯМР-спектроскопия
2.4 Молекулярный докинг 40
2.4.1 "Слепой" докинг 40
2.4.2 "Knowledge-based" докинг 41
2.5 Молекулярная динамика 42
3 Результаты и обсуждение 43
3.1 Очистка белка 43
3.2 ИК-спектроскопия 43
3.3 Метод ЯМР-спектроскопии 45
3.4 Молекулярный докинг с помощью AutoDock 50
3.5 Молекулярный докинг с помощью HADDOCK 54
3.6 Молекулярная динамика 60
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 62
ВЫВОДЫ 64
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 65
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 66
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 67
1 Обзор литературы 8
1.1 Инкапсулирование лекарственных препаратов 8
1.2 Полисахариды 18
1.2.1 Альгинат натрия 18
1.2.2 к-Каррагинан 20
1.2.3 Рамногалактуронан I 22
1.3 РНКаза Bacillus intermedius (биназа) 24
1.4 Физические методы исследования 26
1.4.1 ИК-спектроскопия 26
1.4.2 ЯМР-спектроскопия 27
1.4.3 Двумерная спектроскопия ЯМР 29
1.4.3.1 Общие принципы 29
1.4.3.2 Гомоядерный COSY спектр 31
1.4.3.3 Гомоядерный двумерный TOCSY спектр 32
1.4.3.4 Ядерная спектроскопия с эффектом Оверхаузера 33
1.5 Методы компьтерного моделировани 35
1.5.1 Молекулярный докинг 35
1.5.1.1 AutoDock 37
1.5.1.2 HADDOCK 37
1.5.2 Молекулярная динамика 38
2 Материалы и методы 39
2.1 Материалы 39
2.2 ИК-спектроскопия 39
2.3 ЯМР-спектроскопия
2.4 Молекулярный докинг 40
2.4.1 "Слепой" докинг 40
2.4.2 "Knowledge-based" докинг 41
2.5 Молекулярная динамика 42
3 Результаты и обсуждение 43
3.1 Очистка белка 43
3.2 ИК-спектроскопия 43
3.3 Метод ЯМР-спектроскопии 45
3.4 Молекулярный докинг с помощью AutoDock 50
3.5 Молекулярный докинг с помощью HADDOCK 54
3.6 Молекулярная динамика 60
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 62
ВЫВОДЫ 64
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 65
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 66
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 67
Применение многих перспективных медицинских препаратов ограничено рядом факторов, таких как плохая растворимость в воде, неустойчивость в физиологических условиях при прохождении желудочно-кишечного тракта, проявление токсичности по отношению к здоровым тканям, быстрый спад нужной концентрации лекарственного вещества из-за разложения препарата. Вследствие чего одной из ведущих тенденций в современной фармакологии и медицине является использование систем доставки и защиты лекарственных средств, обеспечивающие сохранность препарата и ее доставку в нужные органы пациента, позволяющие резко снизить нежелательные реакции организма на медикаментозное воздействие, сократить терапевтическую дозу вводимого лекарства [1].
В качестве первых транспортных средств для доставки лекарственный препаратов были использованы вирусы, не способные к репликации, например, ретровирус, аденовирус, адено-ассоциированный вирус и вирусы простого герпеса. Вирусы послужили эффективными переносчиками целевых ДНК в ядра клеток-мишеней, и до сих пор используются в биотехнологии; однако такие недостатки, как малая ёмкость, большие трудозатраты в сочетании с риском возникновения цитопатических эффектов и мутагенеза существенно ограничивают их применимость in vivo.
С появлением и развитием нанотехнологий и тераностики особый интерес вызвало использование наночастиц, одновременно выполняющих роль контрастного агента и транспортного средства для биологически активных веществ. Некоторые виды наночастиц уже находятся на стадии доклинических исследований, однако опасения вызывают их токсичность, тенденция к накоплению в тканях вместе с узким диапазоном размеров.
Также одним из возможных решений задачи адресной доставки препарата является инкапсуляция лекарственного вещества. Инкапсуляция позволяет усилить терапевтический эффект, улучшить фармокинетический профиль, увеличить биодоступность, и одновременно, снизить побочное действие фармацевтических средств, а также повысить химическую и конформационную стабильность. Эффективность инкапсуляции, в первую очередь, определяется особенностями взаимодействия активного вещества с матрицей капсулы, поэтому зачастую разработка систем доставки носит индивидуальный характер. Данный подход дает возможность варьировать тип материалов для сборки капсулы, встраивать в неё структурные элементы для контроля доставки и высвобождения ингредиентов, а также получать капсулы, состоящие из нескольких микрокомпартментов, которые в определенной степени могут рассматриваться как функциональная модель биологических клеток. Для получения капсул не требуется специального дорогостоящего оборудования, при этом их размер, состав и проницаемость могут легко варьироваться в широком диапазоне. Поскольку характер взаимодействий между матрицей капсулы и терапевтическим агентом определяются физико-химической природой, первостепенной задачей при разработке систем инкапсулирования является установление структурных характеристик их комплексов.
В настоящее время малые бактериальные РНКазы рассматриваются в качестве перспективных альтернативы традиционным средствам химиотерапии злокачественных новообразований [2]. Они проявляют селективную цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам и не имеют сродства к ингибиторам РНКаз млекопитающих. В ряде бациллярных РНКаз, биназа - РНКаза Bacillus Intermedius - наиболее хорошо изучена, как функционально, так и структурно.
В качестве материала для формирования микрокапсул используют природные полимеры (липиды, белки, полисахариды), синтетические (полиакрилаты, полидиоксаноны, поликапролактоны), а также их сочетание [3]. Среди преимуществ полисахаридов можно отметить следующие: экономичность, биосовместимость, нетоксичность, биодоступность, биоразлагаемость, к тому же продукты распада полисахаридов не
накапливаются в организме и выводятся из него естественным путем, поэтому они широко используются в медицине. Кроме того, полисахариды, в т.ч. альгинат натрия, к-каррагинан и рамногалукторонан 1 (РГ1), обладают противомикробным, противовирусным и противоопухолевым действием, поэтому они представляют интерес для сочетанной терапии, когда материал капсулы и заключенный в нее белок оказывают комплексное лечебное воздействие.
Целью работы было описать взаимодействия биназы с тремя полисахаридами (альгинатом натрия, к-каррагинаном и РГ1) и выбрать их них наиболее подходящий для целей инкапсуляции биназы, т.е. связывающий белок и обладающий наименьшим влиянием на структуру белка.
Задачи работы:
• Оценить изменения во вторичной структуре биназы при
взаимодействии с полисахаридами методом ИК-спектроскопии;
• Методами двумерной ЯМР-спектроскопии определить остатки
белка, взаимодействующие с РГ1;
• Методом молекулярного докинга охарактеризовать геометрию
комплексов биназы с фрагментом РГ1;
• Методом молекулярной динамики уточнить структуру
рассчитанных комплексов биназы с фрагментом РГ1;
• Провести сравнение результатов эксперимента и компьютерного моделирования;
На первом этапе был проведен анализ стабильности вторичной структуры белка в присутствии полисахаридов с помощью ИК-спектроскопии. С помощью данного метода можно получить информацию о конформации и молекулярных взаимодействиях изучаемого вещества. Положительной особенностью метода инфракрасной спектроскопии является возможность надежно идентифицировать разнообразные функциональные группы: амидная карбонильная, карбоксильная, гидроксильная и др. Изменение положения и интенсивности спектральных полос определяется внутри- и межмолекулярными взаимодействиями, например, образованием водородных связей, что лежит в основе характеристики вторичной структуры белков.
На втором этапе были изучены молекулярные детали образования комплекса биназы с РГ1. На сегодняшний день ЯМР-спектроскопия является одним из самых информативных методов исследования структуры молекул, межмолекулярных взаимодействий, механизмов химических реакций и количественного анализа веществ. Остатки белка, взаимодействующие с РГ1, определялись с помощью методов двумерной ЯМР-спектроскопии (TOCSY, COSY и NOESY) при титровании раствора белка полисахаридом.
Методы компьютерного моделирования являются ценным дополнением к экспериментальными спектральным методам, поскольку они позволяют получить детальную картину взаимодействий молекул на атомном уровне. Метод молекулярного докинга применялся для предсказания энергии связывания и геометрии комплексов белок-полисахарид. Далее, геометрии комплексов уточнялись с помощью метода молекулярной динамики.
Полученные данные расширяют представления о взаимодействиях белков с полисахаридами и позволяют рассматривать РГ1 картофеля в качестве перспективного биополимера для инкапсуляции биназы.
В качестве первых транспортных средств для доставки лекарственный препаратов были использованы вирусы, не способные к репликации, например, ретровирус, аденовирус, адено-ассоциированный вирус и вирусы простого герпеса. Вирусы послужили эффективными переносчиками целевых ДНК в ядра клеток-мишеней, и до сих пор используются в биотехнологии; однако такие недостатки, как малая ёмкость, большие трудозатраты в сочетании с риском возникновения цитопатических эффектов и мутагенеза существенно ограничивают их применимость in vivo.
С появлением и развитием нанотехнологий и тераностики особый интерес вызвало использование наночастиц, одновременно выполняющих роль контрастного агента и транспортного средства для биологически активных веществ. Некоторые виды наночастиц уже находятся на стадии доклинических исследований, однако опасения вызывают их токсичность, тенденция к накоплению в тканях вместе с узким диапазоном размеров.
Также одним из возможных решений задачи адресной доставки препарата является инкапсуляция лекарственного вещества. Инкапсуляция позволяет усилить терапевтический эффект, улучшить фармокинетический профиль, увеличить биодоступность, и одновременно, снизить побочное действие фармацевтических средств, а также повысить химическую и конформационную стабильность. Эффективность инкапсуляции, в первую очередь, определяется особенностями взаимодействия активного вещества с матрицей капсулы, поэтому зачастую разработка систем доставки носит индивидуальный характер. Данный подход дает возможность варьировать тип материалов для сборки капсулы, встраивать в неё структурные элементы для контроля доставки и высвобождения ингредиентов, а также получать капсулы, состоящие из нескольких микрокомпартментов, которые в определенной степени могут рассматриваться как функциональная модель биологических клеток. Для получения капсул не требуется специального дорогостоящего оборудования, при этом их размер, состав и проницаемость могут легко варьироваться в широком диапазоне. Поскольку характер взаимодействий между матрицей капсулы и терапевтическим агентом определяются физико-химической природой, первостепенной задачей при разработке систем инкапсулирования является установление структурных характеристик их комплексов.
В настоящее время малые бактериальные РНКазы рассматриваются в качестве перспективных альтернативы традиционным средствам химиотерапии злокачественных новообразований [2]. Они проявляют селективную цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам и не имеют сродства к ингибиторам РНКаз млекопитающих. В ряде бациллярных РНКаз, биназа - РНКаза Bacillus Intermedius - наиболее хорошо изучена, как функционально, так и структурно.
В качестве материала для формирования микрокапсул используют природные полимеры (липиды, белки, полисахариды), синтетические (полиакрилаты, полидиоксаноны, поликапролактоны), а также их сочетание [3]. Среди преимуществ полисахаридов можно отметить следующие: экономичность, биосовместимость, нетоксичность, биодоступность, биоразлагаемость, к тому же продукты распада полисахаридов не
накапливаются в организме и выводятся из него естественным путем, поэтому они широко используются в медицине. Кроме того, полисахариды, в т.ч. альгинат натрия, к-каррагинан и рамногалукторонан 1 (РГ1), обладают противомикробным, противовирусным и противоопухолевым действием, поэтому они представляют интерес для сочетанной терапии, когда материал капсулы и заключенный в нее белок оказывают комплексное лечебное воздействие.
Целью работы было описать взаимодействия биназы с тремя полисахаридами (альгинатом натрия, к-каррагинаном и РГ1) и выбрать их них наиболее подходящий для целей инкапсуляции биназы, т.е. связывающий белок и обладающий наименьшим влиянием на структуру белка.
Задачи работы:
• Оценить изменения во вторичной структуре биназы при
взаимодействии с полисахаридами методом ИК-спектроскопии;
• Методами двумерной ЯМР-спектроскопии определить остатки
белка, взаимодействующие с РГ1;
• Методом молекулярного докинга охарактеризовать геометрию
комплексов биназы с фрагментом РГ1;
• Методом молекулярной динамики уточнить структуру
рассчитанных комплексов биназы с фрагментом РГ1;
• Провести сравнение результатов эксперимента и компьютерного моделирования;
На первом этапе был проведен анализ стабильности вторичной структуры белка в присутствии полисахаридов с помощью ИК-спектроскопии. С помощью данного метода можно получить информацию о конформации и молекулярных взаимодействиях изучаемого вещества. Положительной особенностью метода инфракрасной спектроскопии является возможность надежно идентифицировать разнообразные функциональные группы: амидная карбонильная, карбоксильная, гидроксильная и др. Изменение положения и интенсивности спектральных полос определяется внутри- и межмолекулярными взаимодействиями, например, образованием водородных связей, что лежит в основе характеристики вторичной структуры белков.
На втором этапе были изучены молекулярные детали образования комплекса биназы с РГ1. На сегодняшний день ЯМР-спектроскопия является одним из самых информативных методов исследования структуры молекул, межмолекулярных взаимодействий, механизмов химических реакций и количественного анализа веществ. Остатки белка, взаимодействующие с РГ1, определялись с помощью методов двумерной ЯМР-спектроскопии (TOCSY, COSY и NOESY) при титровании раствора белка полисахаридом.
Методы компьютерного моделирования являются ценным дополнением к экспериментальными спектральным методам, поскольку они позволяют получить детальную картину взаимодействий молекул на атомном уровне. Метод молекулярного докинга применялся для предсказания энергии связывания и геометрии комплексов белок-полисахарид. Далее, геометрии комплексов уточнялись с помощью метода молекулярной динамики.
Полученные данные расширяют представления о взаимодействиях белков с полисахаридами и позволяют рассматривать РГ1 картофеля в качестве перспективного биополимера для инкапсуляции биназы.
Таким образом, было проведено исследование взаимодействий РНКазы из Bacillus Intermedius, биназы, - белка с известным терапевтическим действием по отношению к раковым клеткам, с рядом полисахаридов, используемых в качестве материалов для инкапсулирования. Тесты структурной целостности, прведенные с помощью ИК-спектроскопии, показали, что биназа частично денатурирует при взаимодействии с линейными анионными полисахаридами, альгинатом натрия и к-каррагинаном, но сохраяет нативную организацию при взаимодействии с РГ1. Анализ спектров показал, что взаимодействия происходят с незаряженными участками полисахарида, которыми могут быть боковые галактановые цепи.
Для установления участков связывания галактанов на поверхности биназы было проведено исследование с использованием совокупности комплементарных методов, а именно двумерной ЯМР-спектроскопии и компьютерного моделирования. Поскольку биназа показывает хорошую дисперсию протонных сигналов в двумерных спектрах, эксперименты COSY, TOCSY и NOESY проводились на немеченных образцах, т.е. на ядрах естесственного содержания. При титровании биназы полисахаридом налюдался систематический сдвиг некоторых кросс-пиков, тогда как положение большинства сигналов не менялось. На основании совментного анализа COSY, TOCSY и NOESY спектров было проведено последовательное отнесение сигналов с идентифицикацией типа остатка и установлением положения по первичной последовательности. Таким образом, было установлено, что связывание полисахарида вызывает отклик от девяти остатков биназы, включая ARG 18, PHE55, ASP 53, TRP 93, SER 79, GLY 52, ASP 85, THR 98, ALA103. Для визуализации комплексов белок-полисахарид, был проведен анализ возможных геометрий с помощью процедуры молекулярного докинга. Использовались аглоритмы "слепого" докинга, без ограничений по местам связывания лиганда, и докинга, основанного на знании, когда конкретизируются остатки белка, взаимодействующие с лигандом (известные из ЯМР-экспериментов). Расчеты позволили выявить дискретные области на поверхности белка, обладающие сродством к галактану. При этом геометрии, полученные с использованием двух алгоритмов, находились в согласии. Однако, предсказанные относительные энергии связывания качественно разнились. Принимая во внимание совокупность полученных в работе данных, AutoDock был оценен, как наиболее надежный алгоритм для оценки взаимодействий белка с низкомолекулярным лигандом. В то же время, для более протяженного фрагмента полисахарида результаты AutoDock содержали значительное количество ошибок из-за неверного учета конформационной гибкости лиганда, в то время как HADDOCK выводит более корректные геометрии. Поскольку образование комплексов, как правило, сопровождается тонкой подстройкой структуры белка, для уточнения геометрии комплексов были проведены расчеты траекторий молекулярной динамики, где вероятность образования комплексов определяется с учетом растворителя (воды), заданного в явном виде. В уточненных геметриях фрагменты полисахарида находились вблизи остатков, определенных с помощью ЯМР-спектроскопии, что указывает на согласие расчетных и экспериментальных данных.
Полученные данные расширяют представления о взаимодействиях белков с полисахаридами и позволяют рассматривать рамногалактуронан 1 в качестве перспективного биополимера для инкапсуляции биназы.
Для установления участков связывания галактанов на поверхности биназы было проведено исследование с использованием совокупности комплементарных методов, а именно двумерной ЯМР-спектроскопии и компьютерного моделирования. Поскольку биназа показывает хорошую дисперсию протонных сигналов в двумерных спектрах, эксперименты COSY, TOCSY и NOESY проводились на немеченных образцах, т.е. на ядрах естесственного содержания. При титровании биназы полисахаридом налюдался систематический сдвиг некоторых кросс-пиков, тогда как положение большинства сигналов не менялось. На основании совментного анализа COSY, TOCSY и NOESY спектров было проведено последовательное отнесение сигналов с идентифицикацией типа остатка и установлением положения по первичной последовательности. Таким образом, было установлено, что связывание полисахарида вызывает отклик от девяти остатков биназы, включая ARG 18, PHE55, ASP 53, TRP 93, SER 79, GLY 52, ASP 85, THR 98, ALA103. Для визуализации комплексов белок-полисахарид, был проведен анализ возможных геометрий с помощью процедуры молекулярного докинга. Использовались аглоритмы "слепого" докинга, без ограничений по местам связывания лиганда, и докинга, основанного на знании, когда конкретизируются остатки белка, взаимодействующие с лигандом (известные из ЯМР-экспериментов). Расчеты позволили выявить дискретные области на поверхности белка, обладающие сродством к галактану. При этом геометрии, полученные с использованием двух алгоритмов, находились в согласии. Однако, предсказанные относительные энергии связывания качественно разнились. Принимая во внимание совокупность полученных в работе данных, AutoDock был оценен, как наиболее надежный алгоритм для оценки взаимодействий белка с низкомолекулярным лигандом. В то же время, для более протяженного фрагмента полисахарида результаты AutoDock содержали значительное количество ошибок из-за неверного учета конформационной гибкости лиганда, в то время как HADDOCK выводит более корректные геометрии. Поскольку образование комплексов, как правило, сопровождается тонкой подстройкой структуры белка, для уточнения геометрии комплексов были проведены расчеты траекторий молекулярной динамики, где вероятность образования комплексов определяется с учетом растворителя (воды), заданного в явном виде. В уточненных геметриях фрагменты полисахарида находились вблизи остатков, определенных с помощью ЯМР-спектроскопии, что указывает на согласие расчетных и экспериментальных данных.
Полученные данные расширяют представления о взаимодействиях белков с полисахаридами и позволяют рассматривать рамногалактуронан 1 в качестве перспективного биополимера для инкапсуляции биназы.