Применение метода анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для исследования различий в нуклеотидных последовательностях ампликонов гена 16S рРНК бактерий
ВВЕДЕНИЕ 3
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
1.1 Генетическая система бактерий 5
1.2 Идентификация бактерий 7
1.3 Ген 16S-рибосомальной РНК 8
1.4 Полимеразная цепная реакция 9
1.5 Рестрикция ДНК 12
1.6 Электрофорез ДНК 15
1.7 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 20
1.8 Анализ insilico 22
1.9 Используемые образцы бактерии 22
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 24
2.1 Методика выделения ДНК 24
2.2 Проведение полимеразной цепной реакции 24
2.3 Проведение реакции рестрикции 26
2.4 Проведение электрофореза 27
2.5 Методика очистки ДНК ампликонов 28
3 РЕЗУЛЬТАТЫ 29
3.1 Выделение ДНК из образцов бактерий 29
3.2 Получение ампликонов гена 16S-рРНК 30
3.3 Проведение рестрикции ампликонов 500L - 1350R 33
3.4 Проведения анализа insilico 34
3.5 Сравнение теоретических и экспериментальных данных 35
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 38
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 39
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 40
Исследование микроорганизмов невозможно без распознавания их принадлежности к тем или иным биологическим родам и видам. Процесс идентификации является важным этапом проведения биологических исследований.
Ранее работы по классификации бактерий основывались на морфологических и физиологических признаках чистых культур. В последние 30 лет возможности для идентификации бактерий расширились в связи с использованием молекулярно-генетических методов [1].
Наибольший прогресс в филогении микроорганизмов был достигнут благодаря секвенированию генов. В частности, секвенирование генов 16S- рРНК и 23S-рРНК, а также анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментовмаркерных ампликонов других генов позволили пересмотреть родственные взаимоотношения между разными бактериями [2,3].
Применение молекулярно-генетического подхода для идентификации микроорганизмов выявило его преимущества по сравнению с традиционным подходом: оно открыло возможность определять некультивируемые организмы. Возникла возможность с помощью единой методологии осуществлять построение филогенетических древ [4].
Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов маркерных ампликонов является одним из наиболее простых методов идентификации бактерий. Для идентификации некоторых микроорганизмов требуется несколько суток, а то и недель. Используя метод анализа ПДРФ результат можно получить в течении дня.
В представленной работе показана применимость метода анализа ПДРФ для идентификации почвенных бактерий.
Цель работы: Используя метод анализа ПДРФ, выявить различия в нуклеотидных последовательностях апликонов гена ^S-рРНК почвенных бактерий и сделать вывод о видовой принадлежности бактерий.
Исходя из данной цели, были поставлены следующие задачи:
1. Из биомассы почвенных бактерий выделить ДНК и получить ампликоны гена 168-рРНК используя пары праймеров 500L - 1350R.
2. Для полученных ампликонов провести реакции рестрикции используя следующий набор рестриктаз:TaqI, HhaI, BspFNI, AfaI, BstHHI.
3. Провести электрофорез продуктов гидролиза и проанализировать полученные электрофореграммы.
4. Провести изучениеншШсо ампликонов гена 500L - 1350R 16S- рРНК методом анализа ПДРФ с использованием данных GenBank, и построить теоретические электрофореграммы.
5. Сравнить теоретические и практические электрофореграммы и сделать вывод о видовой принадлежности бактерий.
Работа выполнена на кафедре Медицинской биологии Института Фундаментальной Биологии и Биотехнологии.
Методом анализа ПДРФ была определена видовая принадлежность 10 образцов почвенных бактерий. В процессе работы была выделена высококачественная ДНК бактерий и проведена ее очистка. Используя полимеразную цепную реакцию были получены ампликоны размером около 900 п.о. гена 168-рРНК. Был проведен рестрикционный анализ исследуемых ампликонов. Полученные данные были сверены с результатами анализа insilico базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК (GenBank). По результатам сравнения исследуемые бактерии оказались представителями видов: Arthrobacter globiformis, Agrobacterium tumefaciens, Achromobacter xylosoxidans, Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescen, Klebsiella pneumoniae, Bacilluscereus, Bacilluspumilus, Bacillusamyloliquefaciens.
Была создана база данных для идентификации различных видов бактерий, которая пригодится в определении вида других бактерий в дальнейших исследованиях.
Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов в совокупности с использованием генетической базы данных секвенированных последовательностей ДНК (GenBank) может служить достаточно простым способом идентификации микроорганизмов. Метод анализа ПДРФ можно использовать для быстрого и малозатратного определения видов микроорганизмов. Он проще определения вида бактерий с использованием других методов идентификации.
