📄Работа №26954
Тема: Определение констант связывания флуоресцентно-меченных нуклеотидов с белками
Характеристики работы
Тип работы
Главы к дипломным работам
Предмет
Биология
Объем:
77 листов
Год:
2016
Просмотров:
317
7300
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
РЕФЕРАТ 2
СОДЕРЖАНИЕ 3
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Комплексы белков с нуклеиновыми кислотами 7
1.2 Методы изучения комплексов белков с нуклеиновыми кислотами 8
1.2.1 Эксперименты по связыванию на нитроцеллюлозных фильтрах 8
1.2.2 Поверхностный плазмонный резонанс 15
1.2.3 Методы флуоресцентной спектроскопии 26
1.2.3.1 Тушение флуоресценции 27
1.2.3.2 Флуоресцентная анизотропия 34
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47
2.1 Материалы 47
2.1.1 Химические реагенты 47
2.1.2 Хроматографические носители 48
2.1.3 Буферы 48
2.1.4 Питательные среды 49
2.1.5 Приборы 49
2.2 Методы 50
2.2.1 Микробиологические методы 50
2.2.1.1 Получение компетентных клеток E.coli 50
2.2.1.2 Трансформация клеток E.coli 51
2.2.2 Биохимические методы при работе с белками 51
2.2.2.1 Экспрессия генов 51
2.2.2.2 Выделение белков 52
2.2.2.3 Тепловая коагуляция белков E.coli 52
2.2.2.4 Гидрофобная хроматография на колонке с носителем Butyl-
Sepharose 52
2.2.2.5 Ионообменная хроматография на колонке с носителем DEAE-
Sepharose 54
2.2.2.6 Аффинная хроматография на колонке с носителем Heparin-
Sepharose 54
2.2.2.7 Аналитическая гель-фильтрация на колонках с носителями
Sephadex G75 и G200 55
2.2.2.8 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) 55
2.2.3 Измерение флуоресцентной анизотропии 56
2.2.4 Теоретическое описание расчета константы на основании данных
титрования 57
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 72
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 73
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 74
СОДЕРЖАНИЕ 3
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Комплексы белков с нуклеиновыми кислотами 7
1.2 Методы изучения комплексов белков с нуклеиновыми кислотами 8
1.2.1 Эксперименты по связыванию на нитроцеллюлозных фильтрах 8
1.2.2 Поверхностный плазмонный резонанс 15
1.2.3 Методы флуоресцентной спектроскопии 26
1.2.3.1 Тушение флуоресценции 27
1.2.3.2 Флуоресцентная анизотропия 34
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47
2.1 Материалы 47
2.1.1 Химические реагенты 47
2.1.2 Хроматографические носители 48
2.1.3 Буферы 48
2.1.4 Питательные среды 49
2.1.5 Приборы 49
2.2 Методы 50
2.2.1 Микробиологические методы 50
2.2.1.1 Получение компетентных клеток E.coli 50
2.2.1.2 Трансформация клеток E.coli 51
2.2.2 Биохимические методы при работе с белками 51
2.2.2.1 Экспрессия генов 51
2.2.2.2 Выделение белков 52
2.2.2.3 Тепловая коагуляция белков E.coli 52
2.2.2.4 Гидрофобная хроматография на колонке с носителем Butyl-
Sepharose 52
2.2.2.5 Ионообменная хроматография на колонке с носителем DEAE-
Sepharose 54
2.2.2.6 Аффинная хроматография на колонке с носителем Heparin-
Sepharose 54
2.2.2.7 Аналитическая гель-фильтрация на колонках с носителями
Sephadex G75 и G200 55
2.2.2.8 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) 55
2.2.3 Измерение флуоресцентной анизотропии 56
2.2.4 Теоретическое описание расчета константы на основании данных
титрования 57
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 72
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 73
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 74
📖 Введение
На протяжении всего своего существования в клетках молекулы РНК взаимодействуют с большим количеством РНК-связывающих белков. Эти белки участвуют в процессах транскрипции и трансляции, в транспорте, локализации и маскировании мРНК и т.п.
Определяющую роль в регуляции таких важных клеточных процессов играет РНК-белковое узнавание. Исследование РНК-белковых взаимодействий позволяет понять механизмы реализации транскрипции и трансляции на молекулярном уровне, а для этого необходимо точно измерять сродство между исследуемыми белками и их РНК-мишенями.
Правильное определение параметров связывания весьма актуально не только для фундаментальных исследований (при изучении взаимодействий и функционирования различных комплексов), но и может иметь существенное значение для решения прикладных задач (в фармакологии, медицине и т.д.), например, при разработке и тестировании лекарственных средств.
В настоящее время разработан ряд биофизических методов, позволяющих понять механизм взаимодействия РНК-белковых комплексов. Одним из таких методов является флуоресцентная анизотропия.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что взаимодействие отдельных рибонуклеотидов с белком Hfq - важным регулятором трансляции многих мРНК в бактериях - происходит в сайтах связывания одноцепочечных РНК, причём ориентация оснований изолированных нуклеотидов и образуемые ими контакты идентичны тем, которые имеются в РНК-белковых комплексах [1]. Это наблюдение позволило предложить метод идентификации мест специфического узнавания оснований одноцепочечных РНК на поверхности белков определением структур нуклеотид-белковых комплексов с помощью рентгеноструктурного анализа. Необходимым и важным подготовительным этапом такого подхода является оценка сродства нуклеотидов к белкам- мишеням, что позволяет оценить стабильность получаемых комплексов и возможность их выделения и кристаллизации для дальнейших исследований.
Целью работы является разработка и апробация методики определения сродства белков, принимающих участие в регуляции транскрипции и трансляции РНК, к флуоресцентно-меченным нуклеотидам.
В рамках работы были поставлены следующие задачи:
• Измерить сродство различных РНК-связывающих белков к рибонуклеотидам аденозинмонофосфату и гуанозинмонофосфату с флуоресцентной меткой (АМФ-MAНT и ГМФ-MAНT) по изменению флуоресцентной анизотропии;
• Вычислить равновесную константу диссоциации комплексов (KD);
• Оценить достоинства и недостатки выбранного метода.
Работа выполнена на базе лаборатории структурных исследований аппарата трансляции и лаборатории физики белка Института белка РАН, г. Пущино.
Определяющую роль в регуляции таких важных клеточных процессов играет РНК-белковое узнавание. Исследование РНК-белковых взаимодействий позволяет понять механизмы реализации транскрипции и трансляции на молекулярном уровне, а для этого необходимо точно измерять сродство между исследуемыми белками и их РНК-мишенями.
Правильное определение параметров связывания весьма актуально не только для фундаментальных исследований (при изучении взаимодействий и функционирования различных комплексов), но и может иметь существенное значение для решения прикладных задач (в фармакологии, медицине и т.д.), например, при разработке и тестировании лекарственных средств.
В настоящее время разработан ряд биофизических методов, позволяющих понять механизм взаимодействия РНК-белковых комплексов. Одним из таких методов является флуоресцентная анизотропия.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что взаимодействие отдельных рибонуклеотидов с белком Hfq - важным регулятором трансляции многих мРНК в бактериях - происходит в сайтах связывания одноцепочечных РНК, причём ориентация оснований изолированных нуклеотидов и образуемые ими контакты идентичны тем, которые имеются в РНК-белковых комплексах [1]. Это наблюдение позволило предложить метод идентификации мест специфического узнавания оснований одноцепочечных РНК на поверхности белков определением структур нуклеотид-белковых комплексов с помощью рентгеноструктурного анализа. Необходимым и важным подготовительным этапом такого подхода является оценка сродства нуклеотидов к белкам- мишеням, что позволяет оценить стабильность получаемых комплексов и возможность их выделения и кристаллизации для дальнейших исследований.
Целью работы является разработка и апробация методики определения сродства белков, принимающих участие в регуляции транскрипции и трансляции РНК, к флуоресцентно-меченным нуклеотидам.
В рамках работы были поставлены следующие задачи:
• Измерить сродство различных РНК-связывающих белков к рибонуклеотидам аденозинмонофосфату и гуанозинмонофосфату с флуоресцентной меткой (АМФ-MAНT и ГМФ-MAНT) по изменению флуоресцентной анизотропии;
• Вычислить равновесную константу диссоциации комплексов (KD);
• Оценить достоинства и недостатки выбранного метода.
Работа выполнена на базе лаборатории структурных исследований аппарата трансляции и лаборатории физики белка Института белка РАН, г. Пущино.
✅ Заключение
В ходе работы были получены следующие результаты:
1. Проведен анализ сродства ряда РНК-связывающих белков к флуоресцентно меченым нуклеотидам АМФ-MAНT и ГМФ-MAНT по изменению флуоресцентной анизотропии
2. Измерены равновесные константы диссоциации для исследуемых комплексов белков с нуклеотидами
1. Проведен анализ сродства ряда РНК-связывающих белков к флуоресцентно меченым нуклеотидам АМФ-MAНT и ГМФ-MAНT по изменению флуоресцентной анизотропии
2. Измерены равновесные константы диссоциации для исследуемых комплексов белков с нуклеотидами
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.