РЕФЕРАТ 2
ВВЕДЕНИЕ 4
1. Обзор литературы 6
1.1 Основные сведения 6
1.1.1 Биолюминесценция высших грибов 6
1.1.1.1 Neonothopanus nambi 7
1.2 История изучения биолюминесценции высших грибов 8
1.2.1 Современные данные о биолюминесцентной системе грибов 12
1.3 Практическое применение биолюминесценции грибов 15
1. Материалы и методы 17
2.1 Объект исследования 17
2.2 Методика получения холодного экстракта 17
2.3 Методика получения горячего экстракта 18
2.4 Реакционная смесь 18
2.5 Определение условий для увеличения интенсивности свечения мицелия N.
nambi 18
2.5.1 Влияние вымачивания в дистиллированой воде на интенсивность
биолюминесценции 18
2.6 Получение фракции люциферазы 19
2.7 Выделение и очистка гидроксилазы из мицелия гриба N. nambi 19
2.8 Концентрирование препарата гидроксилазы 19
2.9 Методика проведения электрофореза 20
2. Результаты и обсуждение 21
2.1 Влияние дистиллированной воды на интенсивность свечения мицелия N.
nambi 21
2.2 Разделение ферментативной части биолюминесцентной системы гриба N.
nambi 22
2.3 Получение высокоочищенного препарата гидроксилазы 24
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 32
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 34
Биолюминесценция высших грибов на данный момент является малоизученным явлением, механизм свечения грибов не раскрыт полностью. Ферментативная часть биолюминесцентной системы до сих пор не выделена и не охарактеризована. Данная работа в области биолюминесценции высших грибов направлена на прояснение некоторых свойств ферментативной системы светящихся грибов.
Целью работы является получение высокоочищенного препарата фермента гидроксилазы, входящей в состав биолюминесцентной системы Neonothopanus nambi.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Разделить ферментативную часть биолюминесцентной системы гриба Neonothopanus nambi.
2. Разработать схему очистки фермента гидроксилазы гриба N. nambi.
3. Выделить препарат фермента гидроксилазы из гриба N. nambi.
Актуальность работы: Исследование биолюминесцентной системы грибов несет в себе фундаментальное и прикладное значение. Прежде всего, фундаментальной задачей является раскрытие механизма свечения грибов, прикладное значение заключается в применении полученных знаний в области биотехнологии и биоинженерии.
Один из путей применения полученных знаний о биолюминесцентной системе грибов - создание высокочувствительных биотестов. В настоящее время распространены биотесты с использованием светящихся бактерий, например, Microtox®. Однако биотесты с использованием биолюминесцентных грибов имеют ряд преимуществ. Светящиеся бактерии, в отличие от грибов, являются в основном морскими организмами, следовательно, эти организмы имеют различные среду обитания, защитные механизмы и чувствительность к токсичным веществам. Разумно предположить, что биолюминесцентные грибы являются наиболее подходящими организмами для анализа загрязнений
почвенных образцов, чем светящиеся бактерии. Биотесты на основе светящихся грибов способны отразить более точный ответ именно на почвенные загрязнения, так как являются наземными организмами. С этой точки зрения светящиеся бактерии подходят для оценки водных образцов [1].
Биолюминесценция высших грибов до сих пор остается не до конца раскрытым явлением. В настоящее время выделен и охарактеризован люциферин биолюминесцентной реакции грибов, однако так и не получено никаких данных о ферментативной части биолюминесцентной системы грибов. В результате проделанной работы были получены данные о некоторых свойствах ферментативной части биолюминесцентной системы гриба.
Впервые из мицелия светящегося гриба Neonothopanus nambi был получен высокостабильный и высокоактивный препарат содержащий ферменты биолюминесцентной системы гриба. Было установлено, что полученный ферментативный препарат гриба содержит две ферментные фракции, совместно принимающие участие в биолюминесцентной реакции, но не проявляющие этой активности по раздельности. С помощью хроматографических методов впервые удалось разделить ферменты биолюминесцентной системы гриба (гидроксилазу и люциферазу). Удалось установить функциональную активность этих ферментов. Были разработаны способы тестирования ферментов биолюминесцентной системы гриба по отдельности. Была разработана схема очистки гидроксилазы, позволившая получить высокоочищенный препарат этого фермента. По результатам белкового электрофореза можно предположить, что полученный препарат гидроксилазы, после анионообменной хроматографии высокого разрешения на колонке с сорбентом MonoQ, представляет собой высокоочищенный препарат, который можно использовать в дальнейшей работе по выявлению природы фермента.
Помимо разработанной методики выделения и очистки фермента гидроксилазы были также получены некоторые свойства этого фермента. Методом гель-фильтрационной хроматографии удалось установить нативную молекулярную массу фермента гидроксилазы, равную 30 - 35 кДа.
Поставленная цель работы была достигнута, сопутствующие задачи также выполнены. Полученные результаты в ходе исследования представляют собой сравнительно новые данные о ферментативной части биолюминесцентной системы гриба Neonothopanus nambi, а именно о ферменте гидроксилазе.
