ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Краткий обзор биолюминесценции грибов 6
1.1.1 Общие представления о грибной люминесценции 6
1.1.2 Ранние исследования механизма биолюминесценции грибов 10
1.2 Объекты исследования Neonothopanus nambi и Pholiota squarrosa 19
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 22
2.1 Материалы и оборудование, используемые в работе 22
2.2 Методика проведенной работы 22
2.2.1 Методика получения горячего экстракта из мицелия гриба N. nambi .. 22
2.2.2 Получение фермента (люциферазы) из мицелия гриба N. nambi для
последующего измерения активности люминесцентной системы 23
2.2.3 Определение оптимальных условий накопления предлюциферина в
мицелии гриба N. nambi 23
2.2.4 Поиск оптимума инкубации супернатанта при 100°C для
Neonothopanus nambi и Pholiota squarrosa 25
2.2.5 Проверка влияния кислотности среды на стабильность и
растворимость субстрата 26
2.2.6 Определение растворителя, способного максимально экстрагировать
предлюциферин из мицелия гриба N. nambi 27
2.2.7 Получение высокоочищенного препарата предлюциферина из мицелия
гриба N. nambi 27
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 29
3.1 Оптимизация схемы получения первичных экстрактов и выделения
предсубстрата из гриба N. nambi 29
3.1.1 Определение оптимумов вымачивания мицелия гриба N. nambi и
инкубации супернатанта 29
3.1.2 Определение растворителя, максимально экстрагирующего
предсубстрат из мицелия гриба N. nambi 32
3.2 Получение высокоочищенного препарата предлюциферина из мицелия
гриба N. nambi 33
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 36
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 37
Биолюминесцентные реакции используются в качестве необходимых аналитических инструментов в различных областях науки и техники, в экологическом мониторинге и биомедицинских исследованиях. Механизм биолюминесценции грибов в настоящее время изучен слабо и не до конца выяснены оптимальные условия для получения максимальной интенсивности свечения в лабораторных условиях.
Актуальность работы заключается в том, что выяснение компонентов люминесцентной системы грибов - это, в первую очередь, фундаментальная задача. Понимание механизма биолюминесценции и достижение длительного испускания света мицелием грибов также позволят решить ряд прикладных задач и будут являться основой для дальнейшего развития и применения люминесцентного метода в научной деятельности (например, для создания биолюминесцентных клеток-сенсоров и сигнальных тестов). Светящиеся грибы также представляют интерес в разработке новых люминесцентных маркеров для анализа в биотехнологии и медицине. Преимуществом грибных биолюминесцентных систем в этом отношении является длительность их свечения и возможность экспозиции тест-системы в воздушной среде.
Изучение организации биолюминесцентной системы грибов позволит выяснить целесообразность и способы практического применения люминесценции грибов в различных областях науки.
Целью данной работы является получение высокоочищенного препарата предлюциферина из мицелия гриба Neonothopanus nambi.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
• Оптимизировать условия подготовки гриба N. nambi с целью получения максимального выхода искомого препарата
• Разработать схему выделения и предлюциферина биолюминесцентной системы гриба N. nambi
Были определены условия накопления в биомассе, стабилизации и хранения предшественника грибного люциферина - гиспидина. С этой целью, была проведена работа по определению оптимального времени вымачивания мицелия гриба Neonothopanus nambi и найдены оптимальные условия накопления предлюциферина в биомассе, при которых наблюдалась его максимальная концентрация. Была установлена оптимальная температура, при которой наблюдалась максимальная интенсивность свечения, она составляет 28°C, и оптимальное время вымачивания мицелия гриба Neonothopanus nambi в дистиллированной воде при данной температуре - 3 часа.
Была разработана и оптимизирована схема выделения и очистки предлюциферина грибов - гиспидина - до практически гомогенного состояния из плодовых тел несветящегося высшего гриба Pholiota squarrosa (Чешуйчатка обыкновенная) и люминесцентного гриба Neonothopanus nambi.
Впервые был получен высокоочищенный препарат гиспидина из мицелия гриба Neonothopanus nambi.
