АНАЛИЗ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ АКТИВНОГО ЦЕНТРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ

СОДЕРЖАНИЕ 3
СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
1 Теоретическая часть 9
1.1 Ферментативный катализ 9
1.2 Бактериальная люцифераза 10
1.2.1 Структура 10
1.2.2 Функция люциферазы в клетках бактерий 12
1.3 Не биолюминесцентные аналоги люциферазы 13
1.3.1 Алкансульфонат монооксигеназа Escherichia coli SsuD 13
1.3.2 Длинноцепочечная алкан монооксигеназа LadA 14
1.4 Метод молекулярного докинга 16
1.4.1 Гибкость белков 16
1.4.2 Гибкость лиганда 18
2 Материалы и методы 19
2.1 Достраивание отсутствующих цепей у BLuc и SsuD 19
2.2 Определение положения активного центра белков 19
2.2.1 Определение активного центра BLuc 19
2.2.2 Определение активного центра структурных аналогов
бактериальной люциферазы 20
2.3 Молекулярный докинг
2.4 Подготовка к старту вычислений в программе NAMD 23
2.4.1 Получение файлов поля и топологии для описания систем 24
2.5 Оценка подвижности активного центра 24
3 Результаты 27
3.1 Определение аминокислотных остатков, формирующих активный
центр бактериальной люциферазы Vibrio harveyi 27
3.2 Определение аминокислотных остатков, формирующих активный
центр аналогов бактериальной люциферазы 27
3.3 Молекулярный докинг восстановленного флавина в активный центр
аналогов бактериальной люциферазы 29
3.4 Определение подвижности аминокислотных остатков активных
центров люциферазы связанной с субстратом и без 29
3.5 Сравнение подвижности аминокислотных остатков активных центров
люциферазы и белков-аналогов 33
3.6 Изменение RMSF атомов LadA и SsuD относительно BLuc+FMNH2... 37
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 39
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Купить

На сегодняшний день, с помощью методов рентгеноструктурного анализа и ЯМР расшифровано большое количество биологических структур, которые активно исследуются при помощи методов теоретического моделирования. Такие подходы позволяют предсказать различные физико¬химические свойства биологических молекул с помощью достаточно мощных компьютеров или вычислительных серверов [1].
Компьютерная симуляция позволяет связать процессы, проходящие на микроуровне, с макроскопическим миром лаборатории. Такие вычисления направлены на изучение и предсказание характера взаимодействия между атомами и молекулами в биологической структуре. Так же симуляция является связующим звеном между теорией и экспериментом, находит свое применение для проверки различных теоретических моделей, для сравнения результатов теоретических и реальных экспериментов, а также в тех случаях, когда проведение реального эксперимента затруднительно (высокая температура или давление).
Безусловно, одной из конечных целей при изучении межмолекулярных взаимодействий в биологических молекулах является сравнение теоретической модели с реальной системой. Следовательно, одной из ab initioцелей молекулярной динамики является сведение различных упрощений и допущений к минимуму. С другой стороны, задачи исследования могут быть направлены только на изучение явлений общего характера или на оценку, насколько хорошо та или иная модель описывает реальную систему. Когда научные изыскания направлены только на эти цели, уже нет такой необходимости в создании полностью реалистичного описания исследуемой системы. Модель, отвечающая общим принципам физики, может достаточно хорошо удовлетворять поставленным перед исследователем задачам [2].
Одной из фундаментальных проблем современной биофизики является проблема соответствия между структурой и функцией белков. Специфика пространственной организации и конформационные свойства белков напрямую связаны с их функцией в живых организмах. В настоящее время далеко не все структурно-функциональные соответствия для белковых макромолекул установлены окончательно. Например, некоторые структурно схожие ферменты могут выполнять разную функцию.
Большинство белков, на основе их третичной структуры, можно разделить на группы, что привело к созданию таких баз данных, как SCOPE [3, 4]. Из этих групп можно выделить семейство ферментов, которые имеют структуру TIM-бочка, состоящую из восьми в/а - структур. К таким белкам относят флавин-зависимые монооксигеназы и фосфат связывающие ферменты [5].
Среди известных флавин-зависимых монооксигеназ одним из наиболее подробно изученных ферментов является бактериальная люцифераза. Данный белок изучался многими группами исследователей, но до сих пор изучение механизмов функционирования бактериальной люциферазы вызывает большой интерес, так как ее пространственная структура обеспечивает уникальное свойство данного фермента - способность катализировать реакцию светоизлучения. Явление биолюминесценции широко применяется в научных исследованиях и коммерческих разработках.
С точки зрения фотофизических процессов для эффективной флуоресценции молекул требуется минимизировать все альтернативные пути дезактивации их энергии возбуждения. В частности, внутренняя конверсия и конформационные перестройки молекулы могут конкурировать с процессом светоизлучения. Для их уменьшения важно повысить жесткость микроокружения возбужденной молекулы. Следовательно, по аналогии с процессом флуоресценции, было выдвинуто следующее предположение: для реализации функции биолюминесценции белкам нужно иметь более «жесткий» (менее подвижный) активный центр.
Данная работа направлена на изучение жесткости активного центра бактериальной люциферазы Vibrio harveyi. Для этого используется сравнительный подход, при котором анализируют параметр жесткости активного центра изучаемого фермента и его структурно-функциональных аналогов. Для бактериальной люциферазы такими аналогами являются алкансульфонат монооксигеназа Escherichia coliи длинноцепочечная алканмонооксигеназа bacillus Geobacillus thermodenitrificans[6], которые катализируют схожие реакции, но не обладают функцией биолюминесценции. Помимо этого, в данной работе проводится сравнительный анализ жесткости активного центра бактериальной люциферазы, связанной с субстратом (восстановленным флавинмононуклеотидом) и без него.
Таким образом, целью работы является анализ подвижности аминокислотных остатков активного центра бактериальной люциферазы по сравнению с белками-аналогами методами молекулярной динамики.
Были поставлены следующие задачи:
- определить аминокислотные остатки, формирующие активный центр алкансульфонат монооксигеназы (SsuD) и длинноцепочечной алкан монооксигеназы (LadA);
- провести молекулярный докинг восстановленного флавинмононуклеотида в активый центр бактериальной люциферазы;
- рассчитать подвижность аминокислотных остатков активных центров подобранного ряда белков и структур;
- провести сравнительный анализ полученных характеристик жесткости активных центров с учетом различия строения белков
Купить