ВВЕДЕНИЕ 3
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Азотфиксирующие бактерии 6
1.2 Генетический аппарат бактерий 7
1.3 Ген 16S рРНК 9
1.4 Полимеразная цепная реакция 10
1.5 Рестрикция ДНК 13
1.6 Электрофорез ДНК 17
1.7 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 22
1.8 Анализ in silico 24
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25
2.1 Объекты исследования 25
2.2 Методика выделения ДНК 25
2.3 Проведение полимеразной цепной реакции 26
2.4 Проведение реакции рестрикции 27
2.5 Проведение электрофореза 28
2.6 Методика очистки ДНК ампликонов 30
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 31
3.1 Выделение ДНК из образцов бактерий 31
3.2 Получение ампликонов гена 16S рРНК 33
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 42
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 43
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 44
ПРИЛОЖЕНИЕ А
Цель работы: Идентифицировать бактерии рода Rhizobiumсреди образцов почвенных бактерий, используя метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена 16S-pPHK.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Выделить из биомассы микроорганизмов ДНК, определить ее концентрацию и качество.
2. Получить ампликоны 500L-1350R гена 16S pPHK и провести реакции рестрикции с полученными ампликонами, чтобы затем с помощью электрофореграммы определить вид исследуемой бактерии.
3. Провести электрофорез полученных продуктов гидролиза ампликонов рестриктазами и задокументировать полученные электрофореграммы.
4. Провести рестрикцию ампликонов 500L-1350R гена 16S-pPHK бактерий рода Rhizobium in silicoс использованием базы данных Genbank.
5. Сравнить практические и теоретические картины электрофоретического разделения рестриктов данных ампликонов и сделать вывод по полученным совпадениям о родовой принадлежности исследуемого образца.
Работа выполнена на кафедре Медицинской биологии в Институте Фундаментальной Биологии и Биотехнологии.
В ходе работы была выделена и очищена ДНК высокого качества из образцов почвенных бактерий. Были получены ампликоны гена 16s рРНК размером около 900 п.о. С полученными ампликонами были проведены реакции рестрикции. Данные, полученные в ходе экспериментов, были сверены с результатами анализа in silicoнуклеотидных последовательностей ДНК из базы данных GenBank. По результатам сравнения построенных электрофореграмм образцы 10 и 11 оказались представителями рода Rhizobium.
Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена 16s рРНК может служить достаточно простым способом идентификации микроорганизмов.
