ВВЕДЕНИЕ 3
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Бактерии рода Pseudomonas 7
1.2 Традиционные методы идентификации микроорганизмов 9
1.3 ДНК 12
1.4 Генетическая система бактерий 13
1.5 Ген 16S рРНК 15
1.6 Выделение ДНК 16
1.7 Полимеразная цепная реакция 18
1.8 Эндонуклеазы рестрикции 22
1.9 Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 24
1.10 Электрофорез ДНК 25
1.11 Анализ in silico 27
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 29
2.1 Объект исследования 29
2.2 Методика выделения ДНК 29
2.3 Методика проведение ПЦР 29
2.4 Методика проведения реакции рестрикции 32
2.5 Методика проведения электрофореза 32
3 РЕЗУЛЬТАТЫ 34
3.1. Выделение ДНК из образцов бактерий 34
3.3. Проведение реакции рестрикции ампликонов 500L-1350R 37
3.5. Сравнение экспериментальных и теоретических данных 43
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 49
Список литературы 50
Цель работы: Идентифицировать бактерии рода Pseudomonasсреди образцов почвенных бактерий, используя метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена 16S-pPHK.
Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:
1. Выделить ДНК из опытных образцов бактерий, определить концентрацию и чистоту полученных препаратов ДНК.
2. Получить ампликоны гена 16S рРНК с использованием пары праймеров 500L и 1350R для данных бактерий.
3. Провести реакции рестрикции для полученных ампликонов.
4. Провести гель-электрофорез полученных рестриктов с маркерами в агарозном геле и проанализировать полученные электрофореграммы для определения вида исследуемых образцов.
5. Провести рестрикцию ампликонов 500L-1350R гена 16S-pPHK бактерий рода Pseudomonas in silicoс использованием базы данных Genbank.
6. Сравнить практические и теоретические картины электрофоретического разделения рестриктов данных ампликонов и сделать вывод по полученным совпадениям о родовой принадлежности исследуемого образца.
Работа выполнена на кафедре Медицинской биологии в Институте Фундаментальной Биологии и Биотехнологии.
В ходе работы была выделена ДНК высокого качества. Были получены ампликоны гена 16S рРНК соответствующих длинам около 900 п.о. С полученными ампликонами были проведены реакции рестрикции. Был проведён рестрикционный анализ in silicoразличных штаммов бактерий рода Pseudomonas,в результате которого установили размеры рестриктов при использовании эндонуклеаз, характерные для данного рода. По результатам сравнения теоретических и практически полученных электрофореграмм было установлено, что к роду Pseudomonasпринадлежит образец бактерий под номером 5.
Метод анализа ПДРФ может служить способом идентификации микроорганизмов. В ходе работы было показано, что его можно использовать для определения микроорганизмов.
