ВВЕДЕНИЕ 5
1 Теоретическая часть 7
1.1 Бактериальная люцифераза 7
1.2 Метод молекулярной динамики 11
1.2.1 Молекулярная механика 11
1.2.2 Силовое поле 12
1.2.3 Периодические граничные условия моделирования для системы
частиц в боксе 14
2 Материалы и методы 16
2.1 Моделируемые системы 16
2.2 Программные средства 16
2.3 Создание модельного окружения для бактериальной люциферазы Vibrio
harveyi 17
2.3.1 Моделирование водного окружения люциферазы 17
2.3.2 Моделирование растворов и сахарозы и глицерина 18
2.4 Подготовка к проведению молекулярной динамикиОшибка! Закладка не
определена.
3 Результаты и обсуждение 26
3.1 Среднеквадратичное отклонение Са атомов люциферазы в модельных
средах 26
3.2 Влияние сред на радиус гирации бактериальной люциферазы 28
3.3 Подвижность аминокислотных остатков активного центра люциферазы в
присутствии глицерина и сахарозы 29
3.4 Анализ положения мобильной петли бактериальной люциферазы в вязких
3.5 Оценка количества водородных связей между белком и модельной
средой 41
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 47
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 49
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Клеточная среда представляет собой сложную динамическую систему функциональных молекул - ферментов, которые в зависимости от внутриклеточного окружения могут быть неактивны или же принимать участие в биохимических реакциях [1]. Высокая эффективность и разрешающая способность современных экспериментальных методов позволили достаточно детально описать некоторые клеточные процессы. Однако, на сегодняшний день остается актуальным вопрос об изучении изолированных ферментов in vitro, с дальнейшим переходом к изучению их поведения в клетке - in vivo. Существует несколько подходов к исследованию данной проблемы:
1) изучение работы ферментов непосредственно в интактной клетке,
2) исследование поведения ферментов в различных модельных средах, имитирующих внутриклеточное окружение и
3) ферментативная инженерия, которая позволяет установить роль отдельных аминокислотных остатков в формировании пространственной структуры белка и выполнении им определенных функций [2].
Ферменты, способные катализировать химическую реакцию окисления органических молекул с образованием квантов света, называются люциферазами. Исследование их структурных особенностей, определяющих механизмы светоизлучения, представляет значительный интерес. В частности, установление механизмов влияния различных сред на физико-химические и динамические характеристики белков, позволит направленно изменять их свойства, варьируя параметры среды.
Бактериальная люцифераза Vibrio harveyi (BLuc) относится к семейству флавин-зависимых монооксигеназ. Параметры, характеризующие
взаимодействие бактериальной люциферазы и различных растворителей, на данный момент изучены не в полной мере [3]. Варьирование состава микроокружения in vitro позволяет изменять различные свойства данного фермента, в том числе определяющие сродство к субстрату и интенсивность светоизлучения. В результате детального анализа влияния сред на структурно-
функциональные характеристики люциферазы можно значительно расширить области ее применения в биотехнологиях [4].
В настоящее время широкое распространение получили методы изучения биологических процессов с помощью компьютерного моделирования in silicio [5]. Одним из таких методов является молекулярная динамика (МД), которая может применяться для моделирования поведения различных макромолекул в явном растворителе. В общем виде в основе данного метода заложены принципы, позволяющие имитировать движение атомов (молекул) с помощью решения уравнений классической Ньютоновской механики при помощи эмпирических потенциалов взаимодействия — силовых полей [6].
На раннем этапе развития методов молекулярного моделирования в 70-х годах, было возможно провести расчеты для систем, содержащих не более сотни атомов. Но развитие компьютерных технологий и методов моделирования позволило описывать биологически-значимые системы, такие как мембранные белки и рибосомы, содержащие 50 000-100 000 атомов [7].
Целью данного исследования является определение влияния вязких сред на динамику структуры бактериальной люциферазы методами молекулярной динамики.
Были поставлены следующие задачи:
- провести вычисление траектории молекулярной динамики для структуры бактериальной люциферазы в модельных средах (вода и водные растворы сахарозы и глицерина различной концентрации);
- оценить изменение подвижности структуры люциферазы, в частности активного центра и прилегающих к нему функционально важных участков, в зависимости от вязкости среды;
- установить особенности взаимодействия между белком и сахарозой/глицерином различной концентрации за счет формирования водородных связей.
В работе было проведено моделирование динамики структуры бактериальной люциферазы в водном окружении и в средах, содержащих 10, 20, 30, 40 % сахарозы или глицерина.
На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы:
1. В исследованных модельных средах структура люциферазы стабильна и не претерпевает значительных конформационных изменений:
• среднеквадратичное отклонение атомов белка от начальной конфигурации составляет 0,8-1,4 А;
• значение радиуса гирации не изменяется со временем и находится в интервале от 26,0 - 26,5 А.
2. Динамика структуры бактериальной люциферазы изменяется в присутствии модельных сред:
• аминокислотные остатки, отвечающие за взаимодействие с изоаллоксазиновым кольцом менее подвижны в растворах с глицерином и сахарозой, чем в водном окружении;
• подвижность мобильной петли и аминокислотных остатков, взаимодействующих с фосфатной группой флавина, уменьшается в растворах с глицерином и не изменяется либо увеличивается в растворах с сахарозой;
• при низких концентрация сахарозы и глицерина (10%) происходит сближение мобильной петли и активного центра фермента на 3-4 А, что может влиять на эффективность связывания субстратов.
3. Выявлены различия во взаимодействии сахарозы и глицерина с поверхностью люциферазы:
• количество водородных связей с глицерином растет пропорционально концентрации, в то время как для сахарозы наблюдается насыщение при концентрации >20%; эффект может объясняться разницей в площади поверхности белка, доступной растворителю;
• независимо от концентрации, количество водородных связей, приходящихся на одну молекулу сахарозы больше, чем на одну молекулу глицерина.
