ВВЕДЕНИЕ 4
1 Обзор литературы 6
1.1 Реакция, катализируемая бактериальной люциферазой 6
1.2 Молекулярный краудинг 10
1.2.1 Влияние молекулярного краудинга на ферментативные реакции.... 11
1.3 Влияние вязких сред на ферментативные реакции 13
1.4 Экспериментальные методы регистрации нестационарной кинетики... 14
1.4.1 Основные принципы регистрации нестационарной кинетики 14
1.4.2 Изучение биолюминесцентных реакций с помощью метода
остановленной струи 18
1.4.3 Кинетика автоокисления восстановленного флавинмононуклеотида
кислородом 21
2 Материалы и методы 23
2.1 Реактивы и оборудование 23
2.2 Методика эксперимента 24
3 Результаты и обсуждение 27
3.1 Кинетика реакции, катализируемой бактериальной люциферазой, в
вязких средах 27
3.2 Численное моделирование 31
ВЫВОДЫ 34
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 36
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 37
Известно, что внутриклеточное пространство представляет собой плотную среду с небольшим количеством свободной воды. Такие условия называются «исключением объема» или «переполнением», «краудингом». Для моделирования такой среды в лабораторных условиях используют краудинг-агенты - инертные полимеры, создающие в растворе условия «переполнения». Современные исследование подтверждают явления, вызванные эффектом краудинга, такие как изменения гидродинамического объема белков, что приводит к сдвигу химического равновесия, а также изменение скорости реакций ассоциации макромолекул.
Но вопрос механизма влияния макромолекулярного краудинга на скорости биохимических процессов по-прежнему остаётся открытым и мало изученным. Такие факторы как повышенная вязкость, изменение конформационной динамики фермента или фермент-субстратных взаимодействий и другие могут оказывать влияние на метаболические процессы в условиях «исключенного объема».
Для понимания принципов функционирования ферментативных цепочек внутри клетки в качестве модельных объектов могут быть рассмотрены биолюминесцентные реакции, о работе которых легко судить по интенсивности свечения.
Целью данной работой было проанализировать эффект молекулярного краудинга на многостадийный биохимический процесс на примере биолюминесцентной реакции бактерий.
Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:
• зарегистрировать нестационарную кинетику реакции,катализируемой бактериальной люциферазой, в присутствии макромолекулярного краудинг-агента и низкомолекулярного вязкого косольвента;
• методами численного моделирования кинетических кривых получить константы скоростей отдельных стадий реакции в вязкой среде и условиях макромолекулярного краудинга;
• проанализировать влияние условий макромолекулярного краудинга и повышенной вязкости на кинетику биолюминесцентной реакции, катализируемой бактериальной люциферазой.
• В присутствии высоко- и низко-молекулярного косольвента наблюдаются схожие зависимости от вязкости среды как для эмпирических (kmax, ken), так и для модельных констант скоростей отдельных стадий реакции, катализируемой бактериальной люциферазой. Это говорит о том, что вязкость - существенный механизм влияния среды на биолюминесцентную реакцию бактерий.
• Скорость выхода свечения на максимум лимитируется стадией связывания флавинмононуклеотида с люциферазой (k1) и характеризуется высокой константой сопряжения активного центра фермента со средой.
• Константа связывания фермент-субстратного комплекса с
молекулярным кислородом (k2) не подвержена влиянию вязкости.
• Стадия связывания альдегида с фермент-субстратным комплексом (k1a) демонстрирует диффузионную зависимость от вязкости среды (5~1) .
• Стадия распада тройного интермедиата, сопряженная с формированием возбужденного состояния, (k4) ускоряется в модельных средах с ростом концентрации косольвента.
