
Тип работы:	Предмет:	Язык работы:

Исследование гена 16S рРНК различных микроорганизмов

Работа №	25783
Тип работы	Главы к дипломным работам
Предмет	биология
Объем работы	49
Год сдачи	2016
Стоимость	7300 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено	372

Не подходит работа?

Узнай цену на написание

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 4
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Традиционные методы идентификации микроорганизмов 6
1.2 ДНК 8
1.2.1 Генетическая система бактерий 10
1.2.2 Ген 16S рРНК 12
1.2.3 Выделение ДНК 13
1.3 Предполагаемые бактерии 15
1.3.1 Бактерии рода Rhizobium 15
1.3.2 Бактерии рода Bacillus 16
1.3.3 Бактерии рода Micrococcus 17
1.4 Образцы бактерий используемые для сравнения 18
1.4.1 Кишечная палочка (Escherichia coli) 18
1.4.2 Водородокисляющая бактерия (Ralstonia eutropha) 19
1.4.3 Фотобактерии (Photobacterium phosphoreum) 19
1.5 Полимеразная цепная реакция 20
1.5.1 Очистка ДНК после реакции амплификации 22
1.5.2 Использование ПЦР 23
1.6 Рестриктный анализ ДНК 27
1.6.1 Звёздчатая активность рестриктаз 29
1.7 Метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 29
1.8 Электрофорез 31
1.9 Секвенирование 32
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34
2.1 Используемые образцы бактерий 34
2.2 Методика выделения ДНК 35
2.3 Проведение ПЦР 35
2.4 Методика очистки ампликонов 36
2.5 Проведение реакции рестрикции 37
2.6 Методика проведения электрофореза 38
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 41
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 42

Введение

Наряду с традиционными методами идентификации микроорганизмов, таких как использование культуральных и морфологических характеристик; химических и биохимических реакций [1], в последнее время широкое применение находят методы определения и сравнения микроорганизмов, основанные на исследовании нуклеотидных последовательностей различных генов микроорганизмов [2] и анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), полученных в результате амплификации отдельных генов бактерий [3]. Часто для идентификации используют гены, кодирующие 16S и 23S рибосомальные РНК, поскольку они присутствуют во всех бактериальных клетках и являются видоспецифичными для большинства микроорганизмов [4]. Использование для идентификации гена 16S рибосомальной РНК, позволяет различать близкородственные виды и подвиды микроорганизмов [5].
Одним из перспективных и современных методов идентификации возбудителя заболевания является идентификация организмов по маркерному гену 16S рРНК. Особенности расположения вариативных и консервативных участков этого гена до конца не изучены. Поэтому детальное изучение последовательностей нуклеотидов в данном гене может помочь при идентификации микроорганизмов.
Цель работы:
Исследовать последовательности нуклеотидов в гене 16S рРНК у опытных образцов бактерий для определения их вида.
Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:
1. Выделить ДНК из опытных образцов бактерий, определить концентрацию и чистоту полученных препаратов ДНК.
2. Получить ампликоны с использованием пар праймеров 8F - 1492L и 500L - 1350R гена 16S рРНК для данных бактерий.
3. Провести реакции рестрикции для полученных ампликонов.
4. Провести гель-электрофорез полученных рестриктов с маркерами в агарозном геле и проанализировать полученные электрофореграммы для определения вида исследуемых образцов.
5. Используя секвенированные последовательности ампликона гена 16S рРНК провести определение вида исследуемых образцов.
Работа была проведена на базе центра коллективного пользования приборов ИФБиБТ, Красноярск.

Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь студентам в написании работ!

ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Курсовые Статьи Диплом Рязань

Литература

1 Зернов, Ю. П. Использование рестрикционного анализа амплифицированного гена 16S РНК для идентификации микроорганизмов на примере бактериальных продуцентов термолабильной щелочной фосфатазы. / Ю. П. Зернов, М. А. Абдурашитов, С. Х. Дегтярев. // Биотехнология. - 2005. - №6. - С. 3-11.
2 Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Хоулта Дж. и др.: 9-е издание в 2-х томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина, - М., 1997
3. Vesterlund, S. R. Molecular identification of cryptic bumblebee species from degraded samples using PCR-RFLP approach / S. R. Vesterlund, J. Sorvari, A. Vasemagi // Molecular Ecology Resources. - 2014. - V. 14, I 1. - P. 122¬126.
4 Schlegel, L. Identification of Major Streptococcal Species by гги-Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis / L. Schlegel, F Grimont, P. D. Grimont, A. Bouvet // Journal of clinical microbiology. - 2003. - V 41, I 2. - P. 657¬666.
5 Зернов, Ю. П. Термолабильная щелочная фосфатаза из психрофильного микроорганизма Alteromonas undina P2 / Ю. П. Зернов, В. С Дедков, Ю. А. Антонова, Н. А. Михненкова, С. Х. Дегтярев // Биотехнология. - 2005. - № 2. - С. 38-43.
6 Онищенко, Г. Г. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей: методические указания / Г. Г. Онищенко. - Москва: Минздрав России, 2003. -37 с.
7 Воробьев, А. А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / А. А. Воробьев. - Москва : Медицинское информационное агентство, 2004. - 690 с.
8 Асонов, Н. Р. Микробиология: учебник / Н. Р. Асонов. - Москва: Колос-Пресс, 2002. - 352 с.
9 Покровский, В. И. Инфекционные болезни и эпидемиология: учебник / В. И. Покровский, С. Г. Пак. - 2-е изд. - Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 697с.
10 Покровская, М. С. Лабораторная диагностика ЗППП и полимеразная цепная реакция: лекция [Электронный ресурс] / к.б.н. М. С. Покровская, Г. Б. Смирнов // ЗАО ЛагиС. - 2002. Режим доступа: http://lages- lab.ru/article_11.htm
11 Ghosh, A. A. glossary of DNA structures from A to Z / A. Ghosh, M. Bansal // Acta Crystallographica Section D. - 2003. - №59. - P. 620-626.
12 Pabo, C. Protein - DNA recognition / C. Pabo, R. Sauer // Annual Review Biochemistry. - 1984. - № 53. - P. 293 - 321.
13 Persson, F. Fluorescence Microscopy of Nanochannel-Confined DNA / F. Persson, F. Westerlund // Single Molecule Analysis. - 2011. - № 783. - P. 159-179.
14 Патрушев, Л. И. Экспрессия генов / Л. И. Патрушев. - Москва : Наука, 2000. - 830 с.
15 Гусев, М. В. Микробиология / М. В. Гусев, Л. А. Минеева — Москва : Изд-во МГУ, 2004. — 448 с.
16 Попова, Н. А. Введение в биологию : учебное пособие / Н. А. Попова. - Нобосибирск : Новосиб. гос. университет, 2012. - 270 с.
17 Квитко, К. В. Генетика микроорганизмов : учебное пособие / К. В. Квитко, И. А. Захаров; под ред. А. В. Пиневича. - Санкт Петербург : Изд. дом СПб. ун-та, 2012. - 268 с.
18 Шестаков, С. В. Как происходит и чем лимитируется горизонталь¬ный перенос генов у бактерий / С. В. Шестаков // Экологическая генетика. - 2007. - Т. 5, № 2. - С. 12-24.
19 Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика / И. Ф. Жимулев. - Новосибирск : Сибирское университетское издательство, 2003. - 480 с.
20 Патрушев, Л. И. Искусственные генетические системы / Л. И. Патрушев. - Москва : Наука, 2004. - 530 с.
21 Колтовая, Н. А. Практикум по молекулярной биологии / Н. А. Колтовая. - Москва : Наука, 2010. - 31 с.
22 Copeland, W. C. Mitochondrial DNA Methods and Protocols / W. C. Copeland // MMB. - 2002. V. 197. - P. 199-212.
23 Moss, D. An Easily Automated, Closed-Tube Forensic DNA Extraction Procedure Using a Thermostable Proteinase / D. Moss, S. A. Harbison, D. J. Saul // Int. J. Legal Med. - 2003. V. 117. - P. 340-349.
24 Rapley, R. The Nucleic Acid Protocols Handbook / R. Rapley // University of Hertfordshire, Hatfield UK, 2000. - P. 3-9.
25 Chachaty, E. Isolating Chromosomal DNA from Bacteria / E. Chachaty, P. Saulnier. // The Nucleic Acid Protocols Handbook, Springer. - 2000. - P. 29-32.
26 Антонова, О. С. Эффективные методы выделения нуклеиновых кислот для проведения анализов в молекулярной биологии / О. С. Антонова, Н. А. Корнева, Ю. В. Белов, В. Е. Курочкин // Научное приборостроение. - 2010. - Т. 20, - № 1. - С. 3-9.
27 Perry, D. Isolation of DNA and RNA / D. Perry, J. David // Methods in Molecular Medicine. - 2001. - V. 31. - P. 25-30.
28 Teeters, M. A. Adsorptive Membrane Chromatography for Purification of Plasmid DNA / M. A. Teeters, S. E. Conrardy, B. L. Thomas // J. Chromatography. - 2003. - V. 989. - P. 165-173.
29 Santosa, D. A. Rapid extraction and purification of environmental DNA for molecular cloning applications and molecular diversity studies / D. A. Santosa //Molecular Biotechnology. - 2001. - V. 17, № 1. - P. 59.
30 Агробактерии [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://gufo.me/content_microslov/agrobakterii-14296.html
31 Сахно, О. Н. Экология микроорганизмов : учебное пособие / О. Н. Сахно, Т. А. Трифонова. - Владимир : Изд-во Владим. гос. ун-та, 2007. - 64 с.
32 Agrobacterium tumefaciens [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://mikrobiki.ru/nauka/klinicheski-vazhnye-bakterii/agrobacterium- tumefaciens.html
33 Калдыркаев, А. И. Биохимические свойства бактерий Bacillus cereus / А. И. Калдыркаев, А. В. Алешкин, Н. А. Феоктистова [и др.] // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве. - 2013. - № 3. - С. 186-188.
34 Феоктистова, Н. А. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus / Н. А. Феоктистова, А. И. Калдыркаев, А. Х. Мустафин // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2011. - Т. 4, № 32. - С. 288-290.
35 Род Micrococcus[Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.bacterio.net/micrococcus.html
36 Facts about E. coli. Diversity of structure of bacteria: - Britannica Online
Encyclopediа. [Электронный ресурс] - Режим доступа:
http://global.britannica.com/science/bacteria/Diversity-of-structure-of-bacteria
37 Vogt, R. L. Escherichia coli O157:H7 outbreak associated with consumption of ground beef / R. L. Vogt, L. Dippold // Public Health Rep. - 2002. V. 120, I 2. - P. 174-176.
38 LeBlanc, J. G. Bacteria as vitamin suppliers to their host: a gut microbiota perspective / J. G. LeBlanc, J. Guy, C. Milani // Current Opinion in Biotechnology. - 2013. V. 24, I 2. - P. 160-168.
39 Hudault, S. Escherichia coli strains colonising the gastrointestinal tract protect germfree mice against Salmonella typhimurium infection / S. Hudault, J. Guignot, A. L. Servin // Gut. - 2001. - V. 49, I 1. - P. 47-55.
40 Thompson, A. E. coli Thrives in Beach Sands / A. Thompson // Live Science. - 2007.
41 Билич, Г. Л. Биология. Т. 1. / Г. Л. Билич, В. А. Крыжановский. - Москва : Оникс, 2009. - 864 с.
42 Chen, Z. Human serum albumin from recombinant DNA technology: Challenges and strategies / Z. Chen, Y. He, B. Shi // Biochimica et Biophysica Acta, 2013. - V. 1830, I 2. - P. 5515-5525.
43 Narang, S. Synthesis and applications of DNA and RNA / S. Narang. Science: Elsevier, 2012. - P. - 230.
44 16S рРНК [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://medica21.ru/index.php?id=261&idd=226
45 Cramm, R. Genomic View of Energy Metabolism in Ralstonia eutropha H16 / R. Gramm // J Mol Microbiol Biotechnology. - 2009. V. 16. - P. 38-52.
46 Дроздов, А. В. Анализ динамики интенсивности биолюминесценции светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum / А. В Дроздов, Е. Н. Громозова, И. А. Грецкий // Биофизика. - 2015. - Т. 60, № 2. - С. 316-321.
47 Budsberg, K. J. Isolation and Identification of Photobacterium phosphoreum from an Unexpected Niche: Migrating Salmon / K. J. Budsberg, C. F. Wimpee, and J. F. Braddock // Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - V. 69, I 11. - P. 6938-6942.
48 Wang, X. Effect of water quality on mercury toxicity to Photobacterium phosphoreum: Model development and its application in natural waters / X. Wang, R. Qu, Z. Wei // Ecotoxicology and Environmental Safety, 2014. - V. 104. - P. 231-238.
49 Ребриков, Д. В. ПЦР в реальном времени: учебник / Д. В. Ребриков, Д. В. Саматов, Д. Ю. Трофимов. - Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с.
50 Гусейнов, О. А. Методы биохимических исследований : учеб. метод. пособие к лаб. занятиям / О. А. Гусейнов. - Красноярск: Сиб. федерал. университет, 2012. - 46 с.
52 Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. - Изд. 3-е - Москва : Медицина, 2007. - 700 c.
53 Лопухов, Л. В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике / Л. В. Лопухов, М. В. Эйдельштейн // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - Т. 2, № 3. - С. 96-106 с.
54 Дмитриев, А. Г. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций: книга / Дмитриев А. Г. - Н.Новгород : НГМА, - 2003. - 336 с.
55 Silaghi, C. H. A. Prevalence and genetic analysis of Anaplasma phagocytophilum and spotted fever group rickettsiae in the tick Ixodes ricinus in urban and periurban sites in Southern Germany / C. H. A. Silaghi. - Germany : VVB Laufersweiler Verlag, 2008. - P.43-45.
56 Shorten, R. J. The Molecular Epidemiology of Mycobacterium tuberculosis in North London / R. J. Shorten. - London: Centre for Clinical Microbiology Department of Infection University College, 2011. - P.317.
57 Султанахмедов, Э. С. Детекция Chlamydia trachomatis в образцах крови как метод диагностики осложненных и персистирующих форм урогенитальной хламидийной инфекции / Э. С. Султанахмедов, С. Р. Утц, Ю. В. Салтыков, В. Л. Мотин, В. А. Федорова // Саратовский научно-медицинский журнал, 2015. -Т 11, № 3. С. 381-385.
58 Garrido, A. Development of a multiplex real-time PCR method for simultaneous detection of Salmonella enterica, Shigella flexneri and Listeria monocytogenes in processed food samples / A. Garrido, M. J. Chapela, B. Roman, M. Ferreira // European Food Research and Technology. - 2012. - V. 234, I 4. - P. 571-580.
59 Белов, Ю. В. Двукомпонентный количественный ПЦР-Анализ / Ю. В. Белов, А. И. Петров, В. Е. Курочкин // Научное приборостроение. -2012. - Т. 22, № 4. - C. 72-76.
60 Yang, S. PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications inacute-care settings / S. Yang, R. E. Rothman // The Lancet Infectious. - 2004. - V.4. - P. 337-348.
61 Дунаева, С. Е. Бактериальные микроорганизмы, ассоциированные с тканями растений в культуре in vitro: идентификация и возможная роль / С. Е. Дунаева, Ю. С Оследкин // Сельскохозяйственная биология. - 2015. - Т.1, № 1. - C. 3-15.
62 Dawson, C. D. Phenotypic and molecular characterisation of Brucella isolates from marine mammals / C. D. Dawson, E. J. Stubberfield, L. L. Perrett // BMC Microbiology. - 2008. - V.8. - P. 224.
63 ГенБанк [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore
64 Langer, M. Molecular characterisation of grapevine yellows associated phytoplasmas of the stolbur-group based on RFLP-analysis of non-ribosomal DNA / M. Langer, M. Maixner //Journal of Grapevine Research. - 2015. - V. 43, I 43. - P. 191-199.
65 Пунина, Н. В. Изучение генетического разнообразия Bacillus thuringiensis, выделенных в различных эколого-географических зонах Украины, при помощи анализа генов 16S рРНК, gyrB и методов ap-пцр и saAFLP / Н. В. Пунина, В. С. Зотов, А. Л. Пархоменко // Acta Naturae (русскоязычная версия). -2013. Т. 5, № 1. - С. 93-103.
66 Рестриктазы в генетике [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://biofile.ru/bio/6842.html
67 Звездчатая активность [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.biohab.ru/index.php?/blog/4/entry-217
68 Звездчатая активность [Электронный ресурс] - Режим доступа: https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/star-activity
69 ПДРФ [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/RFLP.html
70 Альбертс, Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс, Д. Брей, Дж Льюис, М. Рэфф и др. - Москва: Мир, 1994. - Т. 1. - 517 с.
71 Поляничко, А. М Электрофорез в агарозном геле: учебно¬методическое пособие / А. М Поляничко, - Москва : Наука, - 2007. - 157 с.
72 Гекселер, К. Аналитические и препаративные лабораторные методы / К. Гекселер, Э. Экштайн. - Москва : Химия, 1994. - 416 с.
73 Schuster, S. C Next-generation sequencing transforms today's biology / S. C. Schuster // Nature Methods. - 2008. V. 5, I 1. - P. 16-18
74 Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. - Москва: Мир, 2002. — 589 с.
75 Чемерис, А. В. Секвенирование ДНК / А. В. Чемерис, Э.Д. Ахунов, В.А. Вахитов. - Москва : Наука Формат, 1999. - 427 с.
76 Vogelstein, B. Preparative and analytical purification of DNA from agarose / B. Vogelstein, D. Gillespie // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1979. V. 76, I 2. - P. 615-619.