ВВЕДЕНИЕ 5
1. Основная часть 8
1.1 Аптамеры 8
1.1.2 Аптамеры в качестве терапевтических агентов 10
1.2 Хронические неврологические болезни 11
1.2.1 Эпилепсия 12
1.2.2 Эпилептогенез 13
1.2.3 Механизм эпилептогенеза 14
1.3 Противосудорожные лекарственные препараты 15
1.3.1 Вальпроевая кислота 16
1.4 Гематоэнцефалический барьер 18
1.4.1 Эндотелиоциты 20
1.4.2 Перициты 20
1.4.3 Астроциты 21
1.4.4 Нейроны 22
1.4.5 АВС- белки-транспортеры 22
1.5 Транспорт веществ через гематоэнцефалический барьер 24
1.6 Проблемы доставки лекарственных препаратов в мозг через
гематоэнцефалический барьер 25
2. Материалы и методы 27
2.1 Объекты исследования 27
2.2 Методика связывания аптамер со стрептавидином 27
2.3 Методика отчистки органов животных от крови транскардиальной
перфузией 28
2.4 Методика изготовления гистологических криосрезов для оценки
прохождения белка через ГЭБ мыши 29
2.5 Методика электрофореза на агарозном геле 30
2.6 ПЦР- амплифкация аптамер 30
2.7 Методика приготовления стандартов из гомогенатов органов для
построения калибровочной кривой хроматографа 31
2.8 Оценка связывания вальпроевой кислоты с белком срептавидином
методом фильтрации 32
2.9 Методика связывания пула аптамер со стрептавидином и вальпроевой
кислотой 32
3. Результаты и их обсуждение 35
3.1 Получение комплексов вальпроевой кислоты с аптамерами 35
3.2 Оценка эффективного связывания вальпроевой кислоты со
стрептавидином 38
3.3 Оценка эффективности переноса аптамерами белка стрептавидина через
гематоэнцефалический барьер 40
3.4 Исследования транспорта вальпроевой кислоты в головной мозг 42
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 47
ВЫВОДЫ 48
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 49
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Главным барьером на пути прохождения веществ в головной мозг является гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). ГЭБ представляет собой высокодинамичный биологический мембранный комплекс, который регулирует гомеостаз мозга и перенос молекул из крови для удовлетворения потребностей в питательных веществах и энергии. Одновременно с этим, ГЭБ ограничивает проникновение патогенов, токсичных химических веществ и продуктов обмена, поддерживая его целостность. Такой динамический характер ГЭБ является серьезной проблемой для транспортных систем доставки лекарственных препаратов в ткань нейронов при лечении большинства заболеваний и расстройств, поражающий мозг [1].
Примерно 98% малых молекул и почти все крупные молекулы со средней молекулярной массой более 1 кДа, такие как рекомбинантные белки или гидрофобные лекарственные препараты, полностью не могут пересечь гематоэнцефалический барьер. Разработка безопасных и неинвазивных методов доставки лекарственных веществ в мозг представляет собой серьезную проблему и актуальную задачу, для решения которой нужны новые стратегии [2].
В настоящее время больше внимания уделяется доставке молекул лекарственного средства через взаимодействие с конкретными переносчиками или рецепторами, экспрессируемыми на просветной стороне эндотелиальных клеток.
Такими переносчиками могут выступать моноклональные антитела, специфичные к рецепторам ГЭБ или наночастицы. Однако, и те, и другие имеют ряд ограничений в использовании - большой размер и иммуногенность антител, и потенциальная токсичность наночастиц [3].
Аптамеры, короткие олигонуклиотидные РНК или ДНК, способные с высокой аффинностью и специфичностью связываться с молекулой - мишенью являются привлекательными аналогами моноклональных антител. Не уступая последним в специфичности к мишени, аптамеры обладают преимуществами по сравнению с белковыми антителами - они неиммуногенны, нетоксичны, термостабильны, получение с помощью химического синтеза делает их использование экономически выгоднее [4].
Такие достоинства аптамер по сравнению с антителами позволяют заменить последние и использовать аптамеры, специфичные к рецепторам гематоэнцефалического барьера в качестве транспортного вектора, для целенаправленной доставки потенциальных лекарственных препаратов в головной мозг [5].
Терапия заболеваний центральной нервной системы, а в частности эпилепсии, заключается в применении ряда лекарственных препаратов, которые помимо воздействия на очаг воспаления оказывают огромное сопутствующее негативное влияние. Зачастую, применение данной группы таких препаратов вызывает токсические действия на органы и ткани выделительной системы.
В связи с этим нами была поставлена следующая цель - снизить токсичность вальпроевой кислоты за счет ее адресной доставки в головной мозг ДНК-аптамерами.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:
1. Разработать систему адресной доставки вальпроевой кислоты на основе белка стрептавидина и ДНК-аптамеров, в качестве вектора для переноса комплекса через гематоэнцефалический барьер.
2. Разработать метод оценки эффективности адресной доставки комплекса ДНК- аптамеров с ВК в головной мозг мыши.
3. Сравнить содержание ВК в различных тканях у мышей после введения чистой ВК и в комплексе с аптамерами.
Работа выполнена в «Лаборатории биомолекулярных и медицинских технологий» в Красноярском государственном медицинском университете имени профессора В.Ф. Войно- Ясенецкого Минздрава России.
1. Комплекс вальпроевой кислоты с белком стрептавидином и ДНК- аптамерами, могут быть использованы для адресной доставки ВК в головной мозг. Использование биотинилированного аптамера без предварительной гибридизации с праймером позволит повысить эффективность препарата.
2. Разработан метод оценки эффективности адресной доставки комплекса ДНК - аптамеров с ВК в головной мозг мыши.
3. Показано, что аптамеры проносят ВК в комплексе с белком стрептавидином через ГЭБ в головной мозг мыши. Создание комплекса ускоряет процесс выведение вальпроевой кислоты из организма и снижает концентрацию гепатотоксичных метаболитов в печени.
