ВВЕДЕНИЕ 3
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Генетический аппарат бактерий 6
1.2 Ген 16S рРНК 8
1.3 Бактерии рода Arthrobacter 9
1.4 Эндонуклеазы рестрикции 11
1.4.1 Общая характеристика рестриктаз 11
1.4.2 Классификация 12
1.4.3 Основные сферы применения рестриктаз 13
1.4.4 Особенности работы с эндонуклеазами рестрикции 14
1.5 Полимеразная цепная реакция 15
1.6 Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 17
1.7 Электрофорез ДНК 18
1.8 Генетический анализ in silico 22
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23
2.1 Объект исследования 23
2.2 Методика выделения ДНК 23
2.3 Проведение ПЦР 24
2.4 Методика очистки ампликонов 25
2.5 Проведение реакций рестрикции 26
2.6 Проведение электрофореза 27
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 29
3.1 Проведение анализа in silico 29
3.2 Выделение ДНК из биомассы бактерий 33
3.3 Получение и очистка ампликонов гена 16S-pPHK 34
3.4 Рестриктирование ампликонов 500L - 1350R гена 16S рРНК 36
3.5 Сравнение теоретических и экспериментальных данных 38
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 41
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 43
В современном мире практическое значение микроорганизмов трудно переоценить - они применяются в пищевой промышленности и сельском хозяйстве, в медицине и фармакологии, при добыче полезных ископаемых и их переработке, и во многих других сферах жизни человека [1].
Полноценное биологическое исследование с использованием бактерий невозможно без установления их принадлежности к той или иной таксономической группе. Способы идентификации микроорганизмов разрабатывались микробиологами на протяжении долгого времени, и на сегодняшний день многие из них активно используются в науке, медицине и в промышленном производстве.
Известно, что традиционные методы идентификации бактерий с использованием культуральных и морфологических характеристик, а также химических и биохимических реакций имеют ряд недостатков, в частности, невозможность определить видовую принадлежность некультурируемых микроорганизмов. Это определило необходимость применения и совершенствования молекулярно - генетических методов, основанных на изучении и сравнении нуклеотидного состава ДНК. Данные методы отличаются очень высокой специфичностью и чувствительностью, позволяют в короткие сроки идентифицировать микроорганизмы, в том числе некультивируемые (Mycobacterium leprae, Helicobacter pylori), труднокультивируемые (Treponema pallidum) и находящиеся в полимикробных сообществах (микрофлора кишечника), по их уникальным нуклеотидным последовательностям в районе определенных генов [2].
Одним из перспективных и широко используемых генетических методов является метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ДНК [3]. В основе метода анализа ПДРФ лежит использование специфических ферментов - эндонуклеаз рестрикции, способных специфически расщеплять ДНК на строго определённые фрагменты, доступные для препаративного выделения и анализа in vitro. Довольно перспективным для идентификации микроорганизмов оказалось изучение нуклеотидных последовательностей гена, кодирующего 16S рибосомальную РНК [4, 5].
Сегодня более семисот рестриктаз, различных по специфичности и другим физико-химическим свойствам, доступны в виде коммерческих препаратов и регулярно используются в лабораториях для модификации ДНК и решения генно-инженерных задач.
Актуальность работы
Бактерии рода Arthrobacter относятся к группе организмов, активно применяемых в различных биотехнологических процессах. Они обладают способностью к разложению многих природных и синтетических соединений, таких как пластмассы, гербициды, фунгициды, инсектициды; являются деструкторами нитрилов, амидов, нефти и нефтепродуктов. Всё это обусловило важность их применения для создания биопрепаратов, используемых в экологических целях [6, 7].
Одним из этапов в организации любого микробиологического производства или исследования является правильная идентификация микроорганизмов. Применение дорогостоящих и достаточно трудоёмких методов, таких как секвенирование ДНК, не всегда является целесообразным и возможным в конкретных условиях лаборатории. Таким образом, актуальной задачей является поиск и оптимизация других, более доступных и, в то же время, эффективных методов.
В настоящее время метод анализа ПДРФ с использованием генетической базы данных секвенированных последовательностей ДНК (GenBank), служит довольно простым способом идентификации бактерий. Данный метод позволяет достаточно скоро получить результаты, и, в то же время, он не так чувствителен к примесям ДНК, как методы секвенирования.
Цель данной работы: используя метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена 16S-pPHK идентифицировать бактерии рода Arthrobacter среди образцов почвенных бактерий.
На основании поставленной цели были определены следующие задачи:
1) Провести анализ ПДРФ in silico ампликонов 500L - 1350R гена 16S-pPHK бактерий рода Arthrobacter с использованием данных GenBank для рестриктаз BstU I, BstHH I, Hae III, MluC I, Taq I и построить теоретические электрофореграммы
2) Выделить ДНК из биомассы образцов почвенных бактерий, определить её концентрацию и качество
3) С помощью ПЦР получить и очистить ампликоны 500L - 1350R гена 16S рРНК исследуемых бактерий, подвергнуть ампликоны рестрикции с использованием рестриктаз BstU I, BstHH I, Hae III, MluC I, Taq I и проанализировать полученные продукты с помощью электрофореза в агарозном геле
4) Сравнив полученные in silico и практически картины
электрофоретического разделения рестриктов, определить, какие из исследуемых образцов бактерий являются представителями рода Arthrobacer.
Работа выполнена на кафедре Медицинской биологии в Институте Фундаментальной Биологии и Биотехнологии СФУ.
В ходе проведения исследования были выполнены все задачи, поставленные в начале работы. На первом этапе был проведён рестрикционный анализ in silico различных штаммов бактерий рода Arthrobacter, в результате которого установили размеры рестриктов при использовании эндонуклеаз BstHH I, BstU I, Hae III, MluC I и Taq I, характерные для данного рода. Количество и распределение по величинам рестриктов у всех исследованных штаммов оказалось одинаковым. Величины соответствующих по размерам рестриктов отличались не более чем на 1-6 нуклеотид (последнее для самых крупных фрагментов). Так была создана теоретическая основа для идентификации бактерий рода Arthrobacter методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена 16S рРНК. Затем была выделена геномная ДНК 12 исследуемых образцов бактерий, из которой методом ПЦР были получены ампликоны 500L-1350R размером около 900 пар оснований, соответствующие выбранному участку гена 16S рРНК. Далее ампликоны обработали эндонуклеазами рестрикции с последующим электрофорезом и документированием электрофореграмм. Полученные экспериментальные электрофореграммы сравнили с теоретическими.
По результатам сравнения теоретических и практически полученных электрофореграмм было установлено, что к роду Arthrobacter принадлежат образцы бактерий под номерами 5 и 9.
Из 5 использованных ферментов наименее информативной оказалась эндонуклеаза рестрикции MluC I, так как при её использовании наблюдались одинаковые рестрикционные профили для большинства исследуемых образцов, что не позволило четко выявить среди них бактерии рода Arthrobacter. Остальные использованные эндонуклеазы рестрикции позволили нам идентифицировать среди использованных образцов те, профиль рестрикции которых совпадал с теоретическим для микроорганизмов рода Arthrobacter.
Таким образом, результаты данного исследования показали, что метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена 16S рРНК, в дополнение к «традиционным» методам, может служить удобным способом идентификации микроорганизмов при условии грамотного подбора эндонуклеаз рестрикции.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
