Микробиологический синтез полигидроксиалканоатов водородокисляющими бактериями Cupriavidus eutrophus B10646 с использованием прекурсоров
|
Введение 4
1. Обзор литературы 7
1.1. Характеристика полигидроксиалканоатов 7
1.2. Потенциальные источники углерода для синтеза ПГА 9
1.3. Синтез мономера 4ГБ 11
1.4. Влияние условий культивирования на синтез сополимеров поли(3ГБ/4ГБ) 14
1.5. Биохимические пути синтеза ПГА 17
2. Материалы и методы 21
2.1. Объект исследования 21
2.2. Культивирование бактерий и методы измерения параметров
культивирования 21
2.2.2. Контроль химических параметров процесса культивирования бактерий
2.2.3. Определение содержания и состава полимера 25
2.3. Статистическая обработка данных 27
3. Результаты и обсуждения исследования 28
3.1. Определения констант насыщения и ингибирования для глюкозы и
масляной кислоты 28
3.2. Определение наиболее активно действующего прекурсора 30
3.3. Выращивание бактерий CupriaviduseutrophusB10646 на среде,
содержащей в качестве субстрата масляную кислоту 33
3.4. Выращивание бактерий Cupriavidus eutrophus B10646 на среде,
содержащей в качестве субстрата глюкозу 34
3.5. Выращивание бактерий Cupriavidus eutrophus B10646 на разных
концентрациях 4-броммасляной кислоты 35
3.6. Дробные добавки 4-броммасляной кислоты 36
3.7. Свойства сополимеров 3-и 4-гидроксимаслянной кислоты 37
Выводы 40
Литература
1. Обзор литературы 7
1.1. Характеристика полигидроксиалканоатов 7
1.2. Потенциальные источники углерода для синтеза ПГА 9
1.3. Синтез мономера 4ГБ 11
1.4. Влияние условий культивирования на синтез сополимеров поли(3ГБ/4ГБ) 14
1.5. Биохимические пути синтеза ПГА 17
2. Материалы и методы 21
2.1. Объект исследования 21
2.2. Культивирование бактерий и методы измерения параметров
культивирования 21
2.2.2. Контроль химических параметров процесса культивирования бактерий
2.2.3. Определение содержания и состава полимера 25
2.3. Статистическая обработка данных 27
3. Результаты и обсуждения исследования 28
3.1. Определения констант насыщения и ингибирования для глюкозы и
масляной кислоты 28
3.2. Определение наиболее активно действующего прекурсора 30
3.3. Выращивание бактерий CupriaviduseutrophusB10646 на среде,
содержащей в качестве субстрата масляную кислоту 33
3.4. Выращивание бактерий Cupriavidus eutrophus B10646 на среде,
содержащей в качестве субстрата глюкозу 34
3.5. Выращивание бактерий Cupriavidus eutrophus B10646 на разных
концентрациях 4-броммасляной кислоты 35
3.6. Дробные добавки 4-броммасляной кислоты 36
3.7. Свойства сополимеров 3-и 4-гидроксимаслянной кислоты 37
Выводы 40
Литература
За последние десятки лет загрязнение окружающей среды синтетическими полимерами является одной из важнейших проблем современного мира, вопрос о том, как решить эту проблему давно волнует человечество. Все дело в том, что применение синтетических полимеров приносит дисбаланс в углеродный цикл, так как уровень потребления углеродосодержащих ресурсов намного превосходит уровень их восполнения.
Полигидроксиалканоаты (ПГА) - термопластические полиэфиры, синтезируемые различными бактериями в качестве внутриклеточного запасного материала в условиях лимитирования роста питательными элементами (например, азотом, фосфором) и при избыточном содержании источника углерода [34]. ПГА в настоящее время становятся реальными кандидатами на роль материалов XXI века, с ними связаны большие надежды, так как помимо термопластичности аналогично полипропилену и полиэтилену, эти биопластики обладают пьезоэлектрическим эффектом и характеризуются высокой биосовместимостью.
Особо перспективными ПГА являются сополимеры, имеющие низкую кристалличность и обладающие свойствами эластомеров. Это короткоцепочечные сополимеры 3- и 4-гидроксибутирата, а также сополимеры, содержащие, помимо коротко-, среднецепочечные мономеры, например 3- гидроксигексаноат (3ГГ) [40].
На сегодняшний день работ, посвященных синтезу поли(3ГБ/4ГБ), достаточно много, однако результаты, приводимые авторами, в некоторой степени можно считать противоречивыми, главным образом из-за использования разными авторами различных штаммов микроорганизмов, разных ростовых субстратов и условий культивирования. Так же синтез сополимерных ПГА является сложной биотехнологической задачей, так как для их получения в состав среды, как правило, необходимо внесение дополнительных источников углерода в качестве субстратов-предшественников целевых мономеров, которые в подавляющем большинстве ингибируют рост продуцентов. Это негативно сказывается на общей продуктивности процесса биосинтеза по биомассе клеток и общих выходах сополимеров [5]. А значит, возникает необходимость в поиске новых прекурсоров, которые бы не ингибировали рост бактерий и давали более высокое содержание мономера 4ГБ в сополимере.
Наиболее ценным свойством является возможность синтеза биополимеров различного состава с различными свойствами. Существенное внимание многими авторами уделяется бактериямCupriaviduseutrophusвсвязи со способностью этих бактерий аккумулировать ПГА с высокими выходами на различных субстратах, в том числе различного состава (гомогенный полигидроксибутират, более технологичные сополимеры гидроксибутирата с гидроксигексаноатом (поли(3ГБ/3ГГ)), сополимеры 3- и 4-гидроксимасляной кислоты (поли(3ГБ/4ГБ)).В зависимости от содержания фракции 4- гидроксибутирата в сополимере П[3ГБ/4ГБ], полимер может быть как высококристалличным так и эластичным. Сополимеры с высоким содержанием 4ГБ являются термопластичными эластомерами, удлинение при разрыве данных сополимеров имеет более высокие значения по сравнению с большинством общеизвестных пластиков, к примеру, полипропилен и полиэтилен, а предел прочности на разрыв лежит в тех же пределах, что и у этих полимеров. Недавно было показано, что сополимеры с высоким содержанием 4ГБ обладают высокими механическими свойствами и перспективны для применения в медицине, в том числе биоразрушаемых материалов и эндопротезов [7,39].
Цель работы: определение влияния режима углеродного питания на продукцию сополимера 3ГБ/4ГБ, при которых содержание мономера 4ГБ в сополимере будет максимальным с использованием различных прекурсоров и изучение физико-химических свойства сополимеров 3- и 4-гидроксимасляной кислоты.
Задачи:
- Определение влияния субстратов-предшественников (прекурсоров) на синтез мономера 4ГБ и выбор наиболее активного влияющих субстратов- предшественников на выход биомассы, содержание полимера, и процентное содержание мономера 4ГБ в полимере.
- Определение параметров обеспечивающих продуктивный синтез сополимера 3ГБ/4ГБ.
- Изучение физико-химических свойств в зависимости от соотношения мономеров.
Полигидроксиалканоаты (ПГА) - термопластические полиэфиры, синтезируемые различными бактериями в качестве внутриклеточного запасного материала в условиях лимитирования роста питательными элементами (например, азотом, фосфором) и при избыточном содержании источника углерода [34]. ПГА в настоящее время становятся реальными кандидатами на роль материалов XXI века, с ними связаны большие надежды, так как помимо термопластичности аналогично полипропилену и полиэтилену, эти биопластики обладают пьезоэлектрическим эффектом и характеризуются высокой биосовместимостью.
Особо перспективными ПГА являются сополимеры, имеющие низкую кристалличность и обладающие свойствами эластомеров. Это короткоцепочечные сополимеры 3- и 4-гидроксибутирата, а также сополимеры, содержащие, помимо коротко-, среднецепочечные мономеры, например 3- гидроксигексаноат (3ГГ) [40].
На сегодняшний день работ, посвященных синтезу поли(3ГБ/4ГБ), достаточно много, однако результаты, приводимые авторами, в некоторой степени можно считать противоречивыми, главным образом из-за использования разными авторами различных штаммов микроорганизмов, разных ростовых субстратов и условий культивирования. Так же синтез сополимерных ПГА является сложной биотехнологической задачей, так как для их получения в состав среды, как правило, необходимо внесение дополнительных источников углерода в качестве субстратов-предшественников целевых мономеров, которые в подавляющем большинстве ингибируют рост продуцентов. Это негативно сказывается на общей продуктивности процесса биосинтеза по биомассе клеток и общих выходах сополимеров [5]. А значит, возникает необходимость в поиске новых прекурсоров, которые бы не ингибировали рост бактерий и давали более высокое содержание мономера 4ГБ в сополимере.
Наиболее ценным свойством является возможность синтеза биополимеров различного состава с различными свойствами. Существенное внимание многими авторами уделяется бактериямCupriaviduseutrophusвсвязи со способностью этих бактерий аккумулировать ПГА с высокими выходами на различных субстратах, в том числе различного состава (гомогенный полигидроксибутират, более технологичные сополимеры гидроксибутирата с гидроксигексаноатом (поли(3ГБ/3ГГ)), сополимеры 3- и 4-гидроксимасляной кислоты (поли(3ГБ/4ГБ)).В зависимости от содержания фракции 4- гидроксибутирата в сополимере П[3ГБ/4ГБ], полимер может быть как высококристалличным так и эластичным. Сополимеры с высоким содержанием 4ГБ являются термопластичными эластомерами, удлинение при разрыве данных сополимеров имеет более высокие значения по сравнению с большинством общеизвестных пластиков, к примеру, полипропилен и полиэтилен, а предел прочности на разрыв лежит в тех же пределах, что и у этих полимеров. Недавно было показано, что сополимеры с высоким содержанием 4ГБ обладают высокими механическими свойствами и перспективны для применения в медицине, в том числе биоразрушаемых материалов и эндопротезов [7,39].
Цель работы: определение влияния режима углеродного питания на продукцию сополимера 3ГБ/4ГБ, при которых содержание мономера 4ГБ в сополимере будет максимальным с использованием различных прекурсоров и изучение физико-химических свойства сополимеров 3- и 4-гидроксимасляной кислоты.
Задачи:
- Определение влияния субстратов-предшественников (прекурсоров) на синтез мономера 4ГБ и выбор наиболее активного влияющих субстратов- предшественников на выход биомассы, содержание полимера, и процентное содержание мономера 4ГБ в полимере.
- Определение параметров обеспечивающих продуктивный синтез сополимера 3ГБ/4ГБ.
- Изучение физико-химических свойств в зависимости от соотношения мономеров.
1. Исследован рост и выход полимера у бактерий Сирпог)Дикеи горкик В10646 на глюкозе и масляной кислоте в сочетании с тремя прекурсорами:,4-бутандиол, 1,6-гександиол и 4-броммасляная кислота. 4-броммасляная кислота дает показатель процентного содержания мономера 4ГБ в 2-2,5 раза выше, чем 1,4-бутандиол и 1,6-гександиол, тогда как выход биомассы и содержание ПГА примерно равны. Максимальные выходы биомассы 6 г/л и сополимера (до 95 % от веса сухой биомассы) получены в условиях роста бактерий на среде с масляной кислотой и 4-броммасляной кислотой в качестве субстрата-предшественника.
2. Рассчитаны оптимальные коцентрации масляной кислоты (2 г/л) и 4- броммасляной кислоты (2 г/л) для продуктивного синтеза сополимера 3ГБ/4ГБ, было рассчитано, что максимальное содержание 4ГБ 12,7 мол.% достигается на 48 час после добавки прекурсора. А также был организован и исследован дробный режим подачи 4-броммасляной кислоты в культуру. Установлено, что в таком режиме при трехкратной подачи прекурсора в концентрации 2 г/л возможно увеличение содержания 4ГБ до 15,3 мол.%.
3. Установлено, что режимом углеродного питания, заключающегося в варьировании соотношения в среде прекурсор/основной субстрат и режима дозирования 4-броммасляной кислоты в культуру, можно обеспечить условия для синтеза штаммом Cupriavidus eutrophusВ10646 сополимера [поли(3ГБ/4ГБ)] с различным содержанием 4ГБ от2.9 до 15.3 мол.%, которое влияет на физико-химические свойства в сополимере, а так же было показано, что молекулярно-массовые характеристики не зависят от соотношения мономеров,полидисперсность имела зависимость от 2,8 до 3,9 от содержания 4ГБ,а величина значение Мв находятся в широких пределах от 547 - 759 кДа. Включение 4ГБ до 15.3 мол.%. приводит к снижению степени кристалличности (до 42%), не влияя на температуру плавления.
2. Рассчитаны оптимальные коцентрации масляной кислоты (2 г/л) и 4- броммасляной кислоты (2 г/л) для продуктивного синтеза сополимера 3ГБ/4ГБ, было рассчитано, что максимальное содержание 4ГБ 12,7 мол.% достигается на 48 час после добавки прекурсора. А также был организован и исследован дробный режим подачи 4-броммасляной кислоты в культуру. Установлено, что в таком режиме при трехкратной подачи прекурсора в концентрации 2 г/л возможно увеличение содержания 4ГБ до 15,3 мол.%.
3. Установлено, что режимом углеродного питания, заключающегося в варьировании соотношения в среде прекурсор/основной субстрат и режима дозирования 4-броммасляной кислоты в культуру, можно обеспечить условия для синтеза штаммом Cupriavidus eutrophusВ10646 сополимера [поли(3ГБ/4ГБ)] с различным содержанием 4ГБ от2.9 до 15.3 мол.%, которое влияет на физико-химические свойства в сополимере, а так же было показано, что молекулярно-массовые характеристики не зависят от соотношения мономеров,полидисперсность имела зависимость от 2,8 до 3,9 от содержания 4ГБ,а величина значение Мв находятся в широких пределах от 547 - 759 кДа. Включение 4ГБ до 15.3 мол.%. приводит к снижению степени кристалличности (до 42%), не влияя на температуру плавления.