Введение
1 Обзор литературы 5
1.1 Бактерии рода Pseudomonas 5
1.2 Бактерии рода Bacillus 6
1.3 Бактерии родов Achromobacter, Micrococcus, Arthrobacterи
Agrobacterium 7
1.4 Ген 16s рРНК 8
1.5 Полимеразная цепная реакция 9
1.6 Электрофорез 9
1.7 Рестрикция 10
1.8 ПДРФ-анализ 12
2 Материалы и методы 13
2.1 Объекты идентификации 13
2.2 Методика проведения амплификации и рестрикции in silico 13
2.3 Методика выделения ДНК 14
2.4 Проведение электрофореза 14
2.5 Проведение ПЦР 15
2.6 Проведение реакции рестрикции 16
Список литературы 18
Приложение - А 21
Таблица 1 - Рестрикционный анализ ампликонов 500L-1350R 21
Таблица 2 - Рестрикционный анализ ампликонов 8F-1492R 23
Приложение - Б 25
На протяжении всей нашей жизни мы неоднократно сталкиваемся с существами невидимыми нашему глазу. Бактерии являются неотъемлемой частью этой большой группы. Они покорили все среды обитания, приспособились ко всем существующим условиям окружающей среды, в том числе к самым экстремальным. Они стали постоянными соседями других форм жизни, правда, не всегда хорошими. Бактерии способны влиять на другие организмы как положительно, являясь симбионтами, так и отрицательно, становясь паразитами. Есть и представители, которые не зависят от чужого существования. Но и они способны нанести косвенный вред.
Человек научился использовать бактерий во многих сферах деятельности. От производства продуктов, до лабораторных исследований и фармакологии. Бактерий применяют в очистке от нефтяных загрязнений, при удобрении почв. Все эти задачи будут успешно выполняться при правильном определении видовой принадлежности того или иного микроорганизма.
Идентификация бактерий возможна разными методами: микробиологическими, биохимическими, молекулярно-генетическими. В данной работе был использован метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Чаще всего для анализа используются гены 16S и 23 S рРНК, что обусловлено их присутствием во всех бактериальных клетках и их родовой специфичностью. Ген 16S предпочтителен тем, что он имеет небольшой размер, достаточно вариабелен, и по нему уже имеется большая база данных.
Актуальность работы
Не всегда при определении вида бактерий можно обойтись одной парой праймеров и одной рестриктазой. При близком родстве многие виды бактерий будут иметь одинаковые рестрикционные профили для некоторых эндонуклеаз рестрикции, что потребует применения дополнительных рестриктаз. А это в свою очередь приведет к дополнительным материальным затратам и потере времени. Поэтому важно провести предварительный анализ in silico,для поиска оптимального сочетания размеров ампликонов и применяемых рестриктаз.
Цель
Сравнить варианты метода анализа ПДРФ гена 16S рРНК с использованием пар праймеров 500L - 1350R и 8F - 1492R при идентификации почвенных бактерий.
Задачи
1. Провести анализ ПДРФ ампликонов 500L - 1350R и 8F - 1492R гена 16S рРНК массива наиболее распространенных почвенных бактерий с использованием данных GenBank in silicoи построить теоретические электрофореграммы с помощью программы pDRAW32, выявить наиболее эффективные рестриктазы.
2. Выделить ДНК из предоставленных образцов биомассы почвенных бактерий. Проанализировать качество полученных образцов ДНК спектрофотометрическим методом и методом электрофореза в агарозном геле.
3. Провести амплификацию полученной ДНК с использованием пар праймеров 500L и 1350R, 8F и 1492R, проанализировать качество полученных ампликонов методом электрофореза в агарозном геле.
4. Для полученных ампликонов провести реакции рестрикции, провести электрофорез продуктов гидролиза в агарозном геле и оформить полученные электрофореграммы с использованием гель-документирующей системы.
5. Сравнить теоретические и практические электрофореграммы, идентифицировать исследуемые образцы, выяснить эффективность рестриктаз для ампликонов 500L - 1350R и 8F - 1492R при идентификации этих бактерий.
