ВВЕДЕНИЕ 5
1 Литературный обзор 7
1.1 Способы оценки токсичности сред. Биотестирование 7
1.2 Хемилюминесцентные и биолюминесцентные процессы в биологических
системах и их использование 8
1.2.1 Хемилюминесценция в биологических системах и ее применение 10
1.2.1.1 Активные формы кислорода и антиокисданты в биологических
системах 13
1.2.1.2 Антиоксиданты. Свойства и применение 15
1.2.2 Использование биолюминесцентных систем для биотестирования 16
1.2.2.1 Светящиеся бактерии 18
1.2.2.2 Биолюминесцентная система сопряженных ферментативных реакций 19
1.3 Фуллерены и их производные. Структура, получение, свойства и
применение 21
1.3.1 Фуллерены С60 и С70 и их производные 24
1.3.1.1 Фуллерены С60 и С70 24
1.3.1.2 Водорастворимые производные фуллеренов - фуллеренолы и
гидратированные фуллерены 26
1.4 Модельные окислители. Свойства и применение 32
1.4.1 Феррицианид калия 32
1.4.2 Пара-бензохинон 33
1.4.3 Пероксид водорода 35
2 Экспериментальная часть 37
2.1 Реактивы и материалы 37
2.2 Регистрация интенсивности хемилюминесценции и биолюминесценции . 38
2.3 Приготовление реакционных смесей и расчет коэффициентов
детоксикации 38
2.3.1 Биолюминесцентная ферментативная тестовая система 38
2.3.2 Лиофилизированные бактерии Photobacterium phosphoreum 40
2.3.3 Расчет коэффициентов детоксикации 41
2.3.4 Хемилюминесцентный люминольный метод 43
2.4 Анализ последовательности гена 16S рРНК 45
3 Результаты и обсуждение 45
3.1 Использование биолюминесцентных тестовых систем для мониторинга
токсичности фуллеренолов 45
3.2 Содержание пероксидных соединений в растворах биологически активных
соединений (фуллеренолов и гуминовых веществ) 49
3.3 Использование биолюминесцентных тестовых систем для изучения
антиоксидантной активности фуллеренолов 51
3.3.1 Воздействие модельных окислителей на интенсивность биолюминесценции тестовых систем 51
3.3.2 Изменение общей токсичности растворов модельныхокислителей под
действием фуллеренолов. Лиофилизированные бактерии и ферментативная система 53
3.3.3 Изменение окислительной токсичности растворов модельных токсикантов под действием фуллеренолов. Ферментативная система . 57
3.4 Анализ последовательности гена 16S рРНК 61
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 63
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 64
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 65
ПРИЛОЖЕНИЕ
Успехи в разработке, производстве и применении водорастворимых фуллереновых структур намного опережают исследования их свойств, в том числе важных для здоровья человека. Так, например, полигидроксилированные фуллерены или фуллеренолы, обладающие высокой биосовместимостью и широким спектром биологической активности, используются при создании медицинских и фармакологических препаратов: радиопротекторов, антиоксидантов, противоопухолевых, противогрибковых, противовирусных и бактерицидных агентов, агентов для адресной доставки лекарственных веществ. Специфические механизмы и пути, через которые эти наночастицы могут вызывать токсические эффекты или стимулировать физиологическую активность организмов, в частности проявлять антиоксидантные свойства, остаются малоизученными. Поэтому существует острая необходимость оценки их токсических и антиоксидантных свойств.
Новой и перспективной областью применения биолюминесцентных биотестов, основанных на люминесцентных бактериях, является оценка антиоксидантной активности и токсических свойств биологически активных соединений, в частности, фуллеренолов. Известно, что токсичность определяется как угнетение физиологических функций организма. В данных биотестах тестируемый параметр физиологической активности - интенсивность биолюминесценции, которую легко можно зарегистрировать с помощью простых физических методов и приборов. Токсичность фуллеренолов может оцениваться по изменению интенсивности биолюминесценции тестовых систем, антиоксидантная активность - по изменению общей и окислительной токсичностям растворов модельных окислителей при добавлении фуллеренолов в качестве детоксицирующих агентов. Простота используемых биотестов и высокая скорость тестирования позволяют одновременно анализировать большое число проб-образцов в сопоставимых внешних условиях и выполнять надлежащую статистическую обработку эффектов низких концентраций биологически активных соединений. Возможность использования биолюминесцентных систем различной сложности (люминесцентные бактерии и выделенные ферменты) позволяет сравнивать эффекты на клеточном и биохимическом (уровне биомолекул и физико-химических процессов) уровнях и выявить закономерности воздействия токсикантов. Выявить роль актвных форм кислорода в водной среде в процессах изменения токсичности под действием фуллеренолов позволяет хемилюминесцентный метод.
Цель работы - выявление антиоксидантных и токсических свойств ряда фуллеренолов (C6o(OH)xOy и C6o,7o(OH)xOy, где x=22-24, y=2-4; Feo,5C6o(OH)xOy и C6o,7o(OH)xOy, где x+y=4o-42) с использованием биолюминесцентных тестовых систем различной сложности: лиофилизированных бактерий Photobacterium phosphoreum и биферментной системы НАД(Ф)Н:ФМН- оксидоредуктаза - люцифераза.
В качестве модельных окислителей выбраны - комплексная соль железа - K3[Fe(CN)6] и 1,4-бензохинон; в качестве биологически активных соединений - фуллеренолы, гуминовые вещества.
В работе поставлены следующие задачи:
1. Изучить токсические свойства ряда фуллеренолов с использованием
биолюминесцентных тестовых систем различной сложности:
лиофилизированных бактерий P. phosphoreum и биферментной системы НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза - люцифераза. Связать токсичность
фуллеренолов с их структурой и свойствами тестовой системы.
2. Изучить влияние фуллеренолов на токсичность растворов модельных окислителей (1,4-бензохинона и K3[Fe(CN)6]) с помощью бактериальной и ферментативной систем. Оценить изменения общей и окислительной токсичности растворов модельных окислителей в процессах детоксикации фуллеренолами. Связать антиоксидантные свойства фуллеренолов с их структурой.
3. С помощью хемилюминесцентного люминольного метода выявить роль активных форм кислорода (на примере перекисных соединений) в процессах изменения токсичности под действием фуллеренолов. Сравнить эффекты фуллеренолов и гуминовых веществ.
4. Оценить роль мутагенности в токсических и антиоксидантных эффектах фуллеренолов с использованием метода секвенирования последовательности гена 16S рРНК бактерий P. phosphoreum.
1. Определены концентрации фуллеренолов, подавляющие интенсивность биолюминесценции тестовых систем (бактериальной и ферментативной); рассчитаны эффективные концентрации ЕС50. Для ферментативной тестовой системы наиболее токсичны фуллеренолы, в состав которых входят более 24 -ОН-групп, а для бактериальной - смеси фуллеренолов, с различным размером углеродного каркаса.
2. Выявлены концентрации фуллеренолов, при которых они проявляют антиоксидантную активность в растворах органического (1,4-бензохинона) и неорганического (K3[Fe(CN)6]) окислителей. Низкоконцентрационный антиоксидантный эффект фуллеренолов связан с их каталитической активностью (ферментативная система) или эффектом гормезиса (бактериальная система). Детоксикация раствора органического окислителя более эффективна, чем неорганического. Детоксицирующие концентрации фуллеренолов < 10-2 г/л. Наибольшей антиоксидантной активностью обладают фуллеренолы, содержащие 22-24 гидроксильные группы.
3. На примере растворов модельных окислителей продемонстрирована применимость биолюминесцентных тестовых систем для оценки изменений общей и окислительной токсичности при воздействии фуллеренолов в качестве антиоксидантного агента.
4. Изменение содержания АФК (на примере пероксидных соединений) под действием фуллеренолов в реакционных смесях сопровождается изменением интенсивности биолюминесценции тестовых систем.
5. С использованием метода секвенирования показано, что токсические и антиоксидантные эффекты фуллеренолов, обнаруженные в ходе экспериментов, не связаны с мутациями в последовательности гена 16S рРНК бактерий P. phosphoreum.
