РЕФЕРАТ 3
ВВЕДЕНИЕ 6
1 Литературный обзор 8
1.1 Собственная флуоресценция белков 8
1.1.1 Триптофан 8
1.1.2 Тирозин 10
1.1.3 Фенилаланин 12
1.2 Особенности белковой флуоресценции и спектральные классы
триптофановых остатков 13
1.8 Стационарная и спектроскопия с временным разрешением 17
1.3 Время жизни флуоресценции 17
1.3.1 Времена жизни индола и триптофана в водном растворе 18
1.3.2 Время жизни триптофана в белках 19
1.4 Нативная и денатурированная формы белка 20
1.4.1 Методы денатурации белков 22
1.5 Методы определения стадий денатурации белков 23
1.6 Карбоксиангидраза Б 23
1.7 Бактериальная люцифераза 24
2 Материалы и методы 26
2.1 Материалы и методика эксперимента 26
2.2 Оборудование 27
2.3 Метод счета фотонов с временной корреляцией 27
2.4 Обработка данных 29
3 Результаты и обсуждение 31
3.1 Анализ изменения стационарных спектров поглощения и
испускания люциферазы и карбоксиангидразы при денатурации 31
3.2 Анализ разрешенных по времени спектров флуоресценции
люциферазы и карбоксиангидразы 32
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 35
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 36
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 37
Одной из важных задач биофизической химии является поиск ответа на вопросы, каким образом происходит сворачивание белка в его активную форму, и как аминокислотная последовательность первичной структуры определяет пространственное расположение цепи белка. Из-за доступности большого количества возможных структур даже для полипептидной цепи средней длин, механизм случайного поиска нужной конформации в процессе укладки белка маловероятен, поэтому предполагается существование неслучайного пути фолдинга. Следовательно, основной интерес представляет изучение возможный промежуточных состояний, формирующихся при переходе от развернутой структуры к структуре белка в его нативном активном состоянии [1, 2].
Стабильность нативной структуры белка является функцией таких параметров как pH, температура, ионная сила раствора и его химический состав, и изменение этих параметров влияет на различные виды связей, обуславливающих стабильность. Количественный анализ роли данных переменных в формировании структуры белка является предпосылкой в описании сил, ответственных за конформационную стабильность. Основным методом исследований в этой области является оценка конформационных изменений, происходящих в результате воздействия на белковую глобулу различных денатурирующих агентов или при изменении температурного режима [2, 3].
В процессе денатурации многие физические характеристики белка претерпевают изменение. Ряд методов используется для исследования процессов разворачивания белковых структур, в том числе спектроскопия кругового дихроизма, флуоресцентная спектроскопия (включая поляризационную), ЯМР, и другие [4].
Изучение структурных параметров и динамики, а также предсказания структурных изменений в белках с помощью спектроскопических методов, основывается на использовании как внешних (ковалентных и нековалентных)
так и внутренних (триптофан, тирозин, фенилаланин,флавинадениндинуклеотид и т.д.) флуорофоров. Такие спектральные характеристики флуорофоров, как спектры поглощения и испускания, квантовые выходы, поляризация, времена жизни, позволяют получить необходимую информацию о фотофизике системы и взаимодействиях флуорофора со своим окружением. Использование спектроскопии с высоким временным разрешением позволяет проводить оценку микрополярности, микровязкости, сольватационной динамики, а также определять пути релаксации возбужденных состояний, изучать кинетику различных процессов в субпикосекундном и микросекундном масштабе, что делает ее незаменимой при изучении физических, химических и биологических процессов [5, 6].
Целью данного исследования является оценка информативности методов стационарной спектроскопии и спектроскопии с высоким временным разрешением для определения структурных переходов многотриптофановых белков в процессе равновесной денатурации на примере карбоксиангидразы Б быка и бактериальной люциферазы P. leiognati.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести равновесную денатурацию карбоксиангидразы и бактериальной люциферазы мочевиной, определяя характеристики флуоресценции при стационарном возбуждении и спадов интенсивности в наносекундном разрешении.
1. Получить зависимости изменения параметров стационарной и время- разрешённой флуоресценции от концентрации мочевины.
2. Проанализировать кривые конформационных переходов, получаемых на основе различных параметров флуоресценции, с точки зрения стадийности процесса денатурации белков.
3. Проанализировать сходство и различия найденных характеристик флуоресценции двух исследованных белков, опираясь на их трехмерную структуру и микроокружение триптофановых остатков в их составе.
В работе была исследована равновесная денатурация многотриптофановых белков бактериальной люциферазы и карбоксиангидразы Б методами стационарной флуоресцентной спектроскопии и спектроскопии с высоким временным разрешением.
