ВВЕДЕНИЕ 3
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 ДНК 6
1.2 Генетическая система бактерий 7
1.3 Ген 16S рРНК 9
1.4 Бактерии рода Bacillus 10
1.5 Выделение ДНК лизисным методом 12
1.6 Полимеразная цепная реакция 13
1.7 Термостабильные ДНК-полимеразы 15
1.8 Электрофорез 15
1.9 Рестриктный анализ ДНК 17
1.10 Метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 18
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 20
2.1 Используемые образцы биомассы почвенных бактерий рода Bacillus..20
2.2 Методика выделения ДНК 20
2.3 Методика проведения электрофореза 21
2.4 Методика проведения ПЦР 22
2.5 Проведение реакции рестрикции 23
2.6 Методика анализа in silico 24
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 28
ПРИЛОЖЕНИЕ А 33
Бактерии - древнейшая группа организмов. Множество полезных бактерий постоянно сопровождают человека на протяжении всей жизни и защищают наш организм от нежелательных внешних воздействий. Они применяются в пищевой промышленности, в сельском хозяйстве, в медицине, при добыче полезных ископаемых и во многих других сферах жизни человека. В то же время многие бактерии являются причиной различных заболеваний.
Каждый вид бактерий имеет свои особенности, поэтому необходимо уметь быстро и точно идентифицировать их.
Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) является одним из наименее затратных, а главное быстрых методов идентификации бактерий. Используя данный метод, результат можно получить в течение дня. Еще одним преимуществом данного метода является то, что он не так чувствителен к примесям по сравнению с методами секвенирования.
В данной работе показано применение метода анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием рестриктаз Tru9 I и Rsa I для идентификации микроорганизмов на примере бактерий рода Bacillus.
Актуальность работы
Род Bacillus - один из наиболее исследованных и востребованных родов бактерий. Они являются промышленными продуцентами:
1. Ферментов (амилазы, пектиназы, липазы, протеазы);
2. Антибиотиков (субтилина, бацитрацина, грамицидина и др.);
3. Аминокислот (L-глутамата, L-триптофана);
4. Витаминов;
5. Токсинов;
6. Фитогормонов [1].
Данный род бактерий и продукты их жизнедеятельности применяются для создания: биопрепаратов для очистки почв, сточных вод от трудноразлагаемых веществ (нефть, нефтепродукты, тяжелые металлы, пестициды и пр.), противомикробных, противовирусных, противогрибковых препаратов, удобрений. Некоторые бактерии рода Bacillus являются причиной различных заболеваний.
В связи с вышеизложенным существует необходимость уметь точно и правильно идентифицировать вид бактерий рода Bacillus.
Во многих исследованиях применяется рестриктаза Hae III. Её применение оказывается достаточным для определения многих видов бактерий, и она является самой дешевой рестриктазой
Но для определения видов бактерий рода Bacillusприменение рестриктазы Hae III и ампликонов 500L-1350R является сравнительно малоэффективным. Поэтому мы решили найти другие относительно дешевые и более информативные рестриктазы.
Цель данной работы: используя метод анализа ПДРФ гена 16S-pPHK с использованием рестриктаз Tru9 I и Rsa I идентифицировать виды бактерий рода Bacillus.
На основании поставленной цели были определены следующие задачи:
1) Провести анализ ПДРФ in silico ампликонов 8F-1492R и 500L-1350R гена 16S-pPHK бактерий рода Bacillusс использованием данных GenBank для рестриктаз Tru9 I, Rsa I, Hae III и построить теоретические электрофореграммы;
2) Выявить среди образцов почвенных микроорганизмов бактерии рода Bacillus.Выделить ДНК из биомассы образцов бактерий рода Bacillus, определить её концентрацию и качество;
3) С помощью ПЦР получить и очистить ампликоны 8F-1492R и 500L - 1350R гена 16S рРНК исследуемых бактерий, подвергнуть ампликоны рестрикции с использованием рестриктаз Tru9 I, Rsa I, Hae III и проанализировать полученные продукты с помощью электрофореза в агарозном геле;
4) Сравнить полученные in silicoи практически картины электрофоретического разделения рестриктов, идентифицировать виды бактерий.
Работа выполнена на кафедре Медицинской биологии в Институте Фундаментальной Биологии и Биотехнологии СФУ.
