Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Биоразлагаемые пластики - полигидроксиалканоаты 7
1.2 Генетическая система бактерий 8
1.3 Дезоксирибонуклеиновая кислота 10
1.4 Идентификация бактерий 11
1.5 Ген 16S-рибосомальной РНК 13
1.6 Полимеразная цепная реакция 14
1.7 Рестрикция ДНК 17
1.8 Электрофорез ДНК 20
1.9 Полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 25
1.10 Секвенирование последовательностей ДНК 26
1.11 Анализ in silico 28
In silico- термин, обозначающий компьютерное моделирование (симуляцию) эксперимента, чаще биологического. Фраза была создана по аналогии с фразами in vivo(в живом организме) и in vitro(в пробирке), которые часто используются в биологии 28
Применение биоинформационного подхода позволяет планировать и моделировать эксперименты для того что бы снизить вероятность ошибки в ходе практического эксперимента, а также снизить количество ресурсов 28
1.12 Используемые образцы бактерии 29
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 31
2.1 Объекты исследования 3 1
2.2 Методика выделения ДНК 3 1
2.2 Проведение полимеразной цепной реакции 32
2.4 Проведение реакции рестрикции 34
2.5 Проведение электрофореза 36
2.6 Методика очистки ДНК ампликонов 37
БЛАГОДАРНОСТЬ 39
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 40
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 41
Исследование микроорганизмов невозможно без распознавания их принадлежности к тем или иным биологическим родам и видам. Процесс идентификации является одним из самых важных и трудоемких этапов проведения биологических исследований.
Ранние работы по классификации бактерий основывались в основном на морфологических и физиологических признаках при изучении чистых культур. В последние 20 лет возможности для идентификации бактерий существенно расширились в связи с использованием молекулярно¬генетических методов [1].
Наибольший прогресс в реконструкции филогении микроорганизмов был достигнут благодаря секвенированию различных маркерных генов. В частности, секвенирование гена 168-рРНК, а также анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов маркерных ампликонов позволили пересмотреть систематические взаимоотношения между разными бактериями [2, 3].
Применение молекулярно-биологического подхода для идентификации микроорганизмов выявило его принципиальные преимущества по сравнению с традиционным фенотипическим подходом: оно открыло возможность идентифицировать некультивируемые организмы. Появилась возможность с помощью единой методологии осуществлять построение филогенетических систем [4].
Промышленная революция, начавшаяся в Европе в XVIII веке, внесла существенные изменения во взаимоотношения Природы и человека. Человеческая деятельность меняет характер окружающей среды, причем в большинстве случаев, эти изменения оказывают негативное влияние на окружающую среду. Но в то же время любая деятельность - промышленная, сельскохозяйственная, рекреационная - источник жизни человека, основа его существования.
Одной из экологических проблем является загрязнение окружающей среды пластиковыми отходами. Процесс накопления продуктов из пластмасс в окружающей среде, отрицательно сказывается на среде обитания диких животных, а также приводит к их гибели [5].
Решением этой проблемы стала разработка биоразлагаемых пластиков - полигидроксиалканоатов (ПГА). Данный вид пластика получают при помощи бактерий, и они же участвуют в его деградации [6]. По свойствам ПГА напоминают полипропилен, один из самых популярных пластиков, поэтому сегодня активно ведутся исследования возможности их наработки в промышленных масштабах.
Но для того чтобы использовать данный вид пластика нужно изучить микробную составляющую окружающей среды как главного агента биодеградации полимера.
Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) маркерных ампликонов является одним из наиболее малозатратных, быстрых и достоверных методов идентификации бактерий. В то время как для идентификации некоторых микроорганизмов требуется несколько суток, а то и недель, а используя метод анализа ПДРФ результат можно получить в течении дня.
В данной работе показана применимость метода анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для идентификации микроорганизмов на примере ПГА деградирующих бактерий.
Цель работы: Используя метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, идентифицировать видовую принадлежность бактерий-биодеструкторов ПГА и определить применимость этого метода.
Исходя из данной цели, были поставлены следующие задачи:
1. Из биомассы бактерий-биодеструкторов ПГА выделить ДНК и получить ампликоны гена ^S-рРНК используя пары праймеров 500L - 1350R и 8F - 1492L
2. Для полученных ампликонов провести реакции рестрикции используя рестриктазы Hpa II, Hae III, Taq I, Hha I, Sse9 I, Mbo I, BspFN I, Afa I.
3. Провести электрофорез продуктов рестрикции, проанализировать полученные электрофореграммы.
4. Провести анализ in silicoампликонов 500L - 1350R и 8F - 1492L гена ^S-рРНК методом анализа ПДРФ с использованием баз данных GenBank, и построить теоретические электрофореграммы.
5. Сравнить теоретические и практические электрофореграммы и сделать вывод о видовой принадлежности бактерий.
6. Используя полученные секвенированные последовательности ампликонов гена ^S-рРНК образцов бактерий провести определение вида наших образцов с использованием баз данных GenBank и сравнить с результатами полученными методом анализа ПДРФ.
Работа выполнена на кафедре Медицинской биологии в Институте Фундаментальной Биологии и Биотехнологии; ЦКП "Геномика" СО РАН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск.
