Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


СОЗДАНИЕ УЛУЧШЕННОЙ кДНК-БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ METRIDIA LONGA И ЕЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СКРИНИНГ В ОТНОШЕНИИ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ

Работа №22483

Тип работы

Бакалаврская работа

Предмет

биология

Объем работы37
Год сдачи2016
Стоимость4900 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
300
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1. 1 Целентеразин- зависимые биолюминесцентные системы 7
1. 2 Субстрат- связывающий белок 9
1. 3 Выявление новых биолюминесцентных белков 11
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 13
2. 1 Материалы 13
2. 2 Методы 14
2. 2. 1 Реапмлкификация кДНК-библиотеки 14
2. 2. 2 Гель-хроматография кДНК смеси 15
2. 2. 3 Приготовление вектора для клонирования 15
2. 2. 4 Гель-электрофорез ДНК 15
2. 2. 5 Выделение ДНК из геля 16
2. 2. 6 Выделение ДНК щелочным лизисом 16
2. 2. 7 Лигирование с вектором 17
2. 2. 8 Приготовление электрокомпетентных клеток 17
2. 2. 9 Электропорация клеток E. coli 18
2. 2. 10 Быстрый скрининг колоний ПЦР 18
2. 2. 11 Функциональный скрининг 19
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 21
3. 1 Удаление низкомолекулярных фрагментов из смеси кДНК 21
3. 2 Очистка тотальной кДНК перед клонированием 23
3. 3 Приготовление вектора для клонирования 24
3. 4 Создание и анализ экспрессионной кДНК-библиотеки 25
3. 5 Функциональный скрининг кДНК-библиотеки 27
3. 6 Результаты скрининга кДНК-библиотеки 29
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 32
ВЫВОДЫ 33
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 34
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 35


Биолюминесценция встречается везде, будь то толщи земли, наземная
территория или же глубины океана, большая часть обитателей которого
способны светиться сами или же использовать свечение других организмов в
своих целях. Биологический смысл биолюминесценции напрямую связан со
зрительным восприятием сигналов. Свечение используется в качестве
коммуникационного агента, как маскировка или как инструмент для
отпугивания хищников резкими всплесками света. Некоторые особи
используют свет в качестве приманки жертв [25]. Однако, все же свечение
живых организмов является прекрасным и загадочным явлением до сих пор до
конца неизученным.
Наиболее часто светящиеся организмы встречаются среди морских
обитателей. Среди них широко представлены виды, использующие
целентеразин как субстрат биолюминесцентных реакций [19]. Наиболее
изученными биолюминесцентными белками, использующими целентеразин как
субстрат, являются Са2+-регулируемые фотопротеины [23]. Фотопротеины
характеризуются наличием субстрат-связывающего белка. Изучение которого
открывает нам представление о самом механизме биолюминесцентной реакции.
Человек находит применение явления биолюминесценции для
удовлетворения своих потребностей, как пример, в фундаментальных
исследованиях клеточных процессов, анализа белок – белковых процессов, а
также в биоимиджинге in vivo и in vitro.
Технологии биоимиджинга направлены на прижизненное исследование
процессов в биологических объектах. Проведение масштабных прикладных и
фундаментальных исследований в области медицины, фармакологии и
биотехнологии требует развития данных технологий визуализации процессов
живой клетки.
Большое разнообразие целентеразин-зависимых биолюминесцентных
белков, что предоставляет нам природа, позволяет выбрать оптимальный
5репортер для определенных задач и предоставляет материал для дальнейшего
совершенствования биоимиджинговых репортеров [5].
На сегодняшний день все имеющиеся репортерные биолюминесцентные
системы имеют те или иные недостатки и ограничения. Поэтому для
дальнейшего развития данных технологий необходимы поиски новых
биолюминесцентных белков в природе, а также улучшение известных форм с
помощью методов белковой инженерии.
Целью данной исследовательской работы являлось создание улучшенной
кДНК библиотеки генов Metridia longa и ее функциональный скрининг в
отношении биолюминесцентных белков, в частности целентеразинсвязывающего белка.
Выполнение данной работы требовало решения ряда экспериментальных
задач, в список которых входило:
4) Очистить тотальную кДНК Metridia longa от низкомолекулярных
фрагментов;
5) Получить экспрессионную кДНК-библиотеку Metridia longa;
6) Охарактеризовать кДНК-библиотеку по степени рекомбинантности и
среднему размеру вставки;
7) Провести функциональный скрининг кДНК-библиотеки в отношении
биолюминесцентных белков;
a) Разработать метод скрининга и поиск гена кодирующего целентеразинсвязывающий белок (ЦСБ);
b) Дополнительно найти новые люциферазные гены с потенциально
улучшенными свойствами.


Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

Целью данной исследовательской работы являлось создание улучшенной
кДНК библиотеки генов Metridia longa и ее функциональный скрининг в
отношении биолюминесцентных белков, в частности целентеразинсвязывающего белка.
Создание улучшенной кДНК-библиотеки заключалось в очистке смеси
кДНК фрагментов от низкомолекулярной фракции, что требовало проведения
реакции на основе метода селективной супрессии ПЦР с использованием
оригинальных праймеров. Это дало возможность в дальнейшем избавиться от
низкомолекулярных фрагментов методом гель-фильтрации.
Функциональный скрининг в отношении биолюминесцентных белков в
первую очередь был направлен на поиск целентеразин-связывающего белка, а
люциферазы представляют собой побочный продукт поиска. Однако это не
принижает значимость проделанной работы в этом направлении.
При проведении скрининга было использовано два метода для
регистрации свечения и выявления клонов, проявляющих люциферазную
активность: многоступенчатый анализ рассеянной библиотеки, начиная с целой
чашки и оканчивая индивидуальной колонией и биолюминесцентный
имиджинг чашек с точечным отбором люциферазных клонов. Данные методы
позволили проанализировать, по меньшей мере, 4706 клонов и выделить 21
клон, имеющий оптимум свечения при низких температурах.
На следующем этапе невозможность выделения люцифераз, пик
активности свечения которых наблюдается при комнатной температуре, привела
к адаптации метода визуализации люцифераз по свечению на уровне колоний с
использованием биоимиджинговой системы применимо к данной работе.
Благодаря этому выявили и очистили две предположительно новые
люциферазы. Все выделенные люциферазы были отправлены на
секвенирование в ЦКП «Геномика» СО РАН в город Новосибирск.


Borisova, V. V Recombinant Metridia luciferase isoforms: expression, refolding
and applicability for in vitro assay / V. V Borisova, L. A. Frank, S. V Markova, L. P.
Burakova, E. S. Vysotski // Photochem. Photobiol. Sci. – 2008. – Т. 7, № 9 – P. 1025–
1031.
2. Buskey, E.J. Behavioral responses of oceanic zooplankton to simulated
bioluminescence / E. J. Buskey, E. Swift // Biol. Bull. – 1985. – T. 168 – P. 263–275.
3. Charbonneau, H. Ca2+-induced bioluminescence in Renilla reniformis.
Purification and characterization of a calcium-triggered luciferin-binding protein // J.
Biol. Chem. – 1979. – Т. 254, № 3. – P. 769–780.
4. Clarke, G.L. Comparative studies of luminescence in copepods and other pelagic
marine animals / G. L. Clarke, R. J. Conover, C. N. David, J. C. Nicol // J. Mar. Biol.
Ass. U. K. – 1962. – №42 – P. 541–564.
5. Close, D.M. In vivo bioluminescent imaging (BLI): Noninvasive visualization and
interrogation of biological processes in living animals // Sensors. – 2011. – Т. 11, №
1. – P. 180–206.
6. Hays, G.C. Ontogenetic and seasonal variation in the diel vertical migration of the
copepods Metridia lucens and Metridia longa / G. C. Hays // Limnol. Oceanogr. –
1995. – Т. 40, № 8 – P. 1461–1465.
7. Hopcroft, R. Metridia longa [Электронный ресурс] / R. Hopcroft // Cenus of Mar
Life. - United States of America, 2009. - Режим доступа :
http://www.arcodiv.org/watercolumn/copepod/Metridia_longa.html.
8. Hori, K. Structure of native Renilla reinformis luciferin / K. Hori, H. Charbonneau,
R. C. Hart, M. J. Cormier // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1977. – Т. 74, № 10 – P.
4285–4287.
9. Kumar, S. Folding funnels and conformational transitions via hinge-bending
motions. / S. Kumar, B. Ma, C. J. Tsai, H. Wolfson, R. Nussinov // Cell Biochem.
Biophys. – 1999. – Т. 31, № 2 – P. 141–164.
10. Lorenz, W.W. Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis
35luciferase / W. W. Lorenz, R. O. McCann, M. Longiaru, M. J. Cormier // Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. – 1991. – Т. 88, № 10 – P. 4438–4442.
11. Markova, S. V The smallest natural high-active luciferase: cloning and
characterization of novel 16.5-kDa luciferase from copepod Metridia longa / S. V
Markova, M. D. Larionova, L. P. Burakova, E. S. Vysotski // Biochem. Biophys. Res.
Commun. – 2015. – Т. 457, № 1 – P. 77–82.
12. Markova, S. V Coelenterazine-Dependent Luciferases / S. V Markova, E. S.
Vysotski // Biochem. Biokhimi – 2015. – Т. 80, № 6 – P. 714–732. iia a
13. Markova, S. V. Cloning and expression of cDNA for a luciferase from the marine
copepod Metridia longa: A novel secreted bioluminescent reporter enzyme / S. V.
Markova, S. Golz, L. A. Frank, B. Kalthof, E. S. Vysotski // J. Biol. Chem. – 2004. –
Т. 279, № 5 – P. 3212–3217.
14. Matthews, J.C. Substrate and substrate analogue binding properties of Renilla
luciferase / J. C. Matthews, K. Hori, M. J. Cormier // Biochemistry – 1977. – Т. 16,
№ 24 – P. 5217–5220.
15. Morse, D. Role of a luciferin-binding protein in the circadian bioluminescent
reaction of Gonyaulax polyedra / D. Morse, A. M. Pappenheimer, J. W. Hastings // J.
Biol. Chem. – 1989. – Т. 264, № 20 – P. 11822–11826.
16. QIAquick Purification Handbook. – QIAGEN. – №7, 1997.
17. Smith, M.E. Voltage-gated proton channel in a dinoflagellate / M. E. Smith, D.
Morgan, B. Musset, V. V Cherny, A. R. Place, J. W. Hastings, T. E. Decoursey // Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2011. – Т. 108, № 44 – P. 18162–18167.
18. Tannous, B.A. Secreted blood reporters: Insights and applications // Biotechnol.
Adv. – 2011. – Т. 29, № 6. – P. 997–1003.
19. Thomson, C.M. The widespread occurrence and tissue distribution of the
imidazolopyrazine luciferins / C. M. Thomson, P. J. Herring, a K. Campbell // J.
Biolumin. Chemilumin. – 1997. – Т. 12 – P. 87–91.
20. Titushin, M.S. Coelenterazine-binding protein of Renilla muelleri: cDNA cloning,
overexpression, and characterization as a substrate of luciferase / M. S. Titushin, S. V
Markova, L. A. Frank, N. P. Malikova, G. A. Stepanyuk, J. Lee, E. S. Vysotski //
36Photochem. Photobiol. Sci. – 2008. – Т. 7, № 2 – P. 189–196.
21. Valiadi, M. Diversity of the luciferin binding protein gene in bioluminescent
dinoflagellates - Insights from a new gene in noctiluca scintillans and sequences from
gonyaulacoid genera / M. Valiadi, M. D. Iglesias-Rodriguez // J. Eukaryot. Microbiol.
– 2014. – Т. 61, № 2 – P. 134–145.
22. Valiadi, M. Diversity of the luciferin binding protein gene in bioluminescent
dinoflagellates - Insights from a new gene in noctiluca scintillans and sequences from
gonyaulacoid genera / M. Valiadi, M. D. Iglesias-Rodriguez // J. Eukaryot. Microbiol.
– 2014. – Т. 61, № 2 – P. 134–145.
23. Vysotski, E.S. Calcium-regulated photoproteins of marine coelenterates / E. S.
Vysotski, S. V Markova, L. a Frank // Mol. Biol. – 2006. – Т. 40, № 3 – P. 404–417.
24. Ward, W.W. Energy transfer via protein-protein interaction in Renilla
bioluminescence / W. W. Ward, M. J. Cormier // Photochem. Photobiol. – 1978. – Т.
27 – P. 389–396.
25. Бондарь, В.С. Физика и химия биолюминесценции : учеб. пособие / В. С.  
Бондарь, Е. С. Высоцкий, Е. Н. Есимбекова, В. А. Кратасюк, Н. С. Кудряшева,
С. В. Маркова, С. Е. Медведева, Е. В. Немцева, В. Н. Петушков, Н. С.
Родионова, И. Е. Суковатая, Л. А. Франк – Красноярск: СФУ, 2012.– 218 с.
26. Лукьянов, К.А. Cелективная супрессия полимеразной цепной реакции / К.
А. Лукьянов, Н. Г. Гурская, Е. А. Богданова, С. А. Лукьянов // Биоорганическая
химия – 1999. – Т. 25, № 3 – C. 163–170.
37

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.




©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.