Идея изучения отдельных клеток, изолированных в оболочке минерального масла, была предложена в 1954 г. [1], однако только с развитием микрофлюидных технологий удалось обеспечить стабильное и воспроизводимое формирование монодисперсных капель с заданными параметрами, пригодных для количественных исследований. Другими преимуществами микрофлюидных технологий являются высокая скорость формирования капель (диапазон частот образования капель от 0,1 до 10 кГц и выше), малый расход реагентов, а также возможности: полного контроля условий формирования капель, осуществления операций объединения (слияния) или дробления капель, выполнения большого числа экспериментов. Создавая капли малых объемов, можно обеспечить условия для изоляции отдельных клеток или молекул.
Публикации результатов исследований в области «капельной» микрофлюидики показывают ее огромный потенциал для исследования отдельных клеток и изучения процессов их функционирования, для скрининга лекарственных средств и т. д. [2]. Перспективным мы видим создание на основе принципов капельной микрофлюидики биосенсоров на основе биолюминесцентной системы светящихся бактерий. При этом могут использоваться как колонии бактерии в каплях, так и ферменты их биолюминесцентной системы.
Биотесты на светящихся бактериях дают количественную меру токсичности и часто превосходят известные биотесты по быстродействию, точности, чувствительности и простоте, позволяют контролировать одновременно значительное число токсинов [3]. В основе этих методов лежит изменение интенсивности люминесценции биопрепаратов после воздействия того или иного анализируемого вещества. Концентрацию анализируемого вещества определяют, измеряя параметры излучения. Исходя из современных требований, предъявляемых к оценке токсичности веществ. Биолюминесцентным способом можно определить общепризнанные в токсикологии параметры, такие как эффективная концентрация (ЭК-50) — концентрация вещества, которая подавляет функцию люминесценции на 50%, и пороговая концентрация (ЛК-0) или уровень биологически безопасного разведения (УББР) — концентрация (разведение) исследуемого вещества, при достижении которой уровень свечения исследуемых растворов равен интенсивности свечения в контрольных кюветах [3].
Чтобы использовать биолюминесцентные бактерии или ферменты их биолюминесцентной системы, необходимо проверить совместимость материалов (главным образом масел), используемых обычно для формирования капель. Вопрос осложняется тем, что биолюминесценция требует наличие кислорода.
Целью дипломной работы было определение влияние ряда масел на интенсивность свечения бактериальных колоний в каплях.
Для достижения цели необходимо было выполнить следующие задачи:
1. подготовить жидкую среду с бактериями;
2. культивировать бактерий в каплях разного объема, в различных маслах;
3. сравнить уровни свечения полученных колоний в каплях;
4. аналогичным способом проверить уровень свечения при добавлении веществ — загрязнителей окружающей среды.
Изучение штамма Photobacterium phosphoreumв силиконовых, растительном, оливковом и минеральном маслах, показали, что ни одно из выбранных масел не останавливает рост колоний бактерий.
Наилучшее свечение наблюдается в силиконовых маслах, однако силиконовое масло высокой вязкости (60000 сСт) не подходит для формирования капель в чипах в силу того, что требуется большое давление чтобы подавать его по каналам чипа. Силиконовое масло вязкостью 200 сСт подходит для формирования капель в тонких капиллярах.
В минеральном масле наблюдается в два раза меньшая интенсивность биолюминесцении, чем в силиконовом масле вязкостью 200 сСт. Возможно это связано с влиянием масла на количество кислорода в капле среды с бактериями. Для подтверждения или опровержения этой гипотезы требуются дополнительные эксперименты с определением кислорода в маслах.
Показана возможность проведения биологических экспериментов с бактериями в «каплях-реакторах», которые заключаются в исследовании параметров биолюминесценции в колониях светящихся бактерий после инжектирования веществ в «каплю-реактор».
Метод биотестирования со светящимися бактериями адаптирован для использования в капельной микрофлюидике. Наилучшим маслом для проведения экспериментов с чипами является силиконовое масло марки «ПМС-200».
