ВВЕДЕНИЕ 4
1 Структура и спектрально-люминесцентные характеристики карбоксиангидразы Б (обзор литературы) 6
1.1 Первичная, вторичная, третичная структура ВСА II и выполняемая функция 6
1.2 Пути сворачивания/разворачивания ВСА II 7
1.3 Собственная люминесценция белков 9
1.4 Методы определения времен жизни флуоресценции 12
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 16
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 18
3.1 Спектры флуоресценции ВСА II с мутацией A53C/A76C при денатурации 18
3.2 Времена жизни флуоресценции ВСА II с мутацией A53C/A76C при денатурации 19
3.3 Спектры флуоресценции, ассоциированные с временами жизни, для
ВСА II с мутацией A53C/A76C при денатурации 21
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 26
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 28
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 29
Экспериментальное определение стадий сворачивания/разворачивания белковых макромолекул является проблемой, до сих пор не нашедшей универсального решения для всех белков. Считается, что метод равновесной денатурации в большинстве случаев не дает информации о промежуточных состояниях белков, разворачивание которых проходит в несколько стадий. Более того, до сих пор открыт вопрос, являются ли промежуточные состояния одними и теми же при равновесной денатурации и кинетических измерениях [1]. Перспективными методами регистрации состояния белковой глобулы являются, с нашей точки зрения, методы флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением.
Измерение спектра собственной флуоресценции белков можно использовать для различных целей. Во-первых, так можно получить ценную структурную информацию о белках, хотя эта информация локальная, поскольку отражает структуру и свойства ближайшего окружения белковых хромофоров. Во-вторых, используя изменения белковой флуоресценции, индуцируемые различными эффекторами, можно делать заключения о характере структурных изменений, вызванных этими эффекторами. В-третьих, некоторые параметры флуоресценции могут быть использованы для определения различных физических и физико-химических характеристик белков [2].
Методы флуоресцентной спектроскопии белков отличаются высокой чувствительностью к изменению структуры макромолекул. Однако необходимо отметить, что собственная флуоресценция белка не обязана быть чувствительной к любому событию в белке. Могут быть ситуации, когда ароматические аминокислотные остатки, которые дают люминесцентную информацию, локализованы в областях, структура и подвижность которых не затрагиваются событиями в других областях белка.
По спектральным параметрам флуоресценции при стационарном возбуждении, как правило, анализируют денатурацию белков в равновесных условиях. Для определения скоростей отдельных стадий разворачивания белков, проходящих сложный путь денатурации, флуоресцентный метод используют, как правило, «точечно» - регистрируют изменение интенсивности при фиксированной длине волны. Для одного белка переходы, определяемые равновесным и кинетическим методом, как правило, не совпадают. Метод равновесной денатурации обычно считается непригодным для наблюдения отдельных этапов многостадийного процесса. При этом, время-разрешенная флуоресценция представляется перспективным методом, способным предоставить дополнительную информацию о промежуточных состояниях макромолекул, даже без кинетических измерений.
Целью настоящей работы является анализ изменения времен жизни триптофановой флуоресценции карбоксиангидразы Б с двойной мутацией Ala53Cys/Ala76Cys в ходе равновесной денатурации мочевиной.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. определить изменения характеристик стационарной и время- разрешенной флуоресценции карбоксиангидразы Б вследствие введения двойной мутации;
2. получить времена жизни флуоресценции карбоксиангидразы Б с двойной мутацией на разных стадиях денатурации и проанализировать видимые переходы между промежуточными состояниями белка;
3. рассчитать спектральные компоненты, ассоциированные с временами жизни флуоресценции двойного мутанта карбоксиангидразы Б, на разных стадиях денатурации и проанализировать на их основании переходы между промежуточными состояниями белка.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского научного фонда (проект №16-14-10115).
Проделанное исследование направлено на поиск новых информативных параметров, позволяющих экспериментально наблюдать многостадийное сворачивание/разворачивание белковых макромолекул. Была исследована возможность использования в качестве таких новых параметров время- разрешенных характеристик собственной флуоресценции белка, таких как времена жизни флуоресценции и спектры, с ними ассоциированные.
Были изучены время-разрешенные характеристики карбокисангидразы быка с двойной мутацией Ala53Cys/Ala76Cys в условиях равновесной денатурации, а также определены времена жизни флуоресценции и проанализировано их изменение в зависимости от концентрации в растворе денатурирующего агента (мочевины).
На основании полученных в работе результатов были сделаны следующие выводы:
1. Двойная мутация с введением дисульфидного мостика на в-шпильке карбоксиангидразы не изменяет характеристики стационарной флуоресценции белка, но укорачивает среднее время жизни флуоресценции.
2. В ходе равновесной денатурации мочевиной наблюдается:
• уменьшение времени жизни флуоресценции т1(5.4 нс), по изменению которого определяется переход с серединой при 5.64 ± 0.26 М;
• увеличение времени жизни флуоресценции т2(1.26 нс), по изменению которого определяется переход с серединой при 6.81 ± 0.09 М.
3. Переходы, определяемые по изменению времен жизни флуоресценции т1и т 2, для карбоксиангидразы с двойной мутацией Ala53Cys/Ala76Cys соответствуют характеристикам промежуточных стадий денатурации данного белка, полученным ранее кинетическими методами.
4. Сдвиги спектров, ассоциированных со временами жизни флуоресценции т1 и т2, не несут дополнительной информации по сравнению со стационарными спектрами флуоресценции, поскольку середины переходов, получаемых по данным параметрам, совпадают.
В целом, результаты данного исследования подтверждают, что пути сворачивания/разворачивания белков в ходе кинетических измерений и при равновесной денатурации могут быть одни и те же, то есть проходить через одинаковый набор промежуточных состояний.
