ВВЕДЕНИЕ 3
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Биоразлагаемые пластики - полигидроксиалканоаты 6
1.2 Генетический аппарат бактерий 7
1.3 Идентификация бактерий 9
1.4 Ген 16S-рибосомальной РНК 10
1.5 Полимеразная цепная реакция 11
1.6 Рестрикция ДНК 14
1.7 Электрофорез ДНК 17
1.8 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 22
1.9 Анализ in silico 24
1.10 Используемые образцы бактерии 25
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 27
2.1 Объекты исследования 27
2.2 Методика выделения ДНК 28
2.3 Проведение полимеразной цепной реакции 28
2.4 Проведение реакции рестрикции 30
2.5 Проведение электрофореза 31
2.6 Методика очистки ДНК ампликонов 32
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 34
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 35
В ходе проведения биологических исследований с использованием бактерий необходимо определить принадлежность микроорганизмов к тем или иным биологическим родам и видам.
Более ранние работы по принадлежности бактерий основывались на морфологических и физиологических признаках чистых культур. За последние 30 лет возможности идентификации бактерий существенно расширились в связи с использованием молекулярно-генетических методов.
Применение молекулярно-биологического подхода для идентификации микроорганизмов выявило его принципиальные преимущества по сравнению с традиционным фенотипическим подходом: оно открыло возможность идентифицировать некультивируемые организмы. Появилась возможность с помощью единой методологии осуществлять построение филогенетических систем [1].
В результате промышленной революции, начавшейся в Европе в XVIII веке, произошли существенные изменения во взаимоотношении Природы и человека. Человеческая деятельность меняет характер окружающей среды, оказывая негативное влияние. Но в то же время любая деятельность - промышленная, сельскохозяйственная, рекреационная - это основа существования человека [2].
Активная хозяйственная деятельность и стремительный рост населения планеты приводят к увеличению объема выпуска изделий из синтетических пластмасс. Полиэтиленовый мусор выводит из строя канализационные и дренажные системы городов, загрязняет водоемы.
Решением этой проблемы стало широкое внедрение целевых продуктов, синтезируемых микроорганизмами. Ценным продуктом бактерий способным заменить искусственные полимерные изделия являются микробные полигидроксиалканоаты. ПГА - полимеры гидроксипроизводных жирных кислот (т.н. биопластики). ПГА перспективны в качестве разрушаемой упаковки пищи и напитков, предметов гигиены и санитарии разработка биоразлагаемых пластиков - полигидроксиалканоатов (ПГА). Главным агентом биодеградации полигидроксиалканоатов являются некоторые виды микроорганизмов.
Для того чтобы использовать данный вид пластика нужно изучить микробную составляющую окружающей среды как главного агента биодеградации полимера.
Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) является одним из наиболее быстрых, достоверных и менее затратных методов идентификации бактерий. В то время как для идентификации некоторых микроорганизмов требуется несколько суток, а то и недель, то используя данный метод результат можно получить в течении дня.
В данной работе показана применимость метода анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для идентификации микроорганизмов на примере ПГА-деградирующих бактерий.
Актуальность работы
Процесс идентификации микроорганизмов является одним из самых важных и трудоемких этапов проведения бактериологических исследований.
В связи с использованием молекулярно-генетических методов стало возможным более точно и быстро идентифицировать микроорганизмы.
Наибольший прогресс в реконструкции филогении микроорганизмов был достигнут благодаря расшифровке последовательностей большого количества генов. В частности, секвенирование гена 168-рРНК позволило пересмотреть систематические взаимоотношения между разными бактериями.
Определение вида микроорганизмов по маркерному гену 16S рРНК является перспективным и современным методом. Расположения вариативных и консервативных участков этого гена довольно хорошо изучены. А детальное изучение нуклеотидных последовательностей в исследуемом гене необходимо при идентификации микроорганизмов.
Метод анализа ПДРФ вместе с использованием генетической базы данных секвенированных последовательностей ДНК (GenBank), служит довольно простым способом определения вида. Данный метод не так чувствителен к примесям ДНК, как метод секвенирования. Анализ ПДРФ является достоверным, относительно быстрым и малозатратным методом идентификации конкретных микроорганизмов в исследуемой среде.
Цель работы: Определить вид бактерий-биодеструкторов ПГА, используя метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и выяснить какие рестриктазы наиболее информативные.
Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:
1. Из биомассы бактерий-биодеструкторов ПГА выделить ДНК и получить ампликоны гена 16S-pPHK, используя пару праймеров 500L - 1350R.
2. Для полученных ампликонов провести реакции рестрикции используя рестриктазы Hae III, BstU I, Sse9 I, BspFN I, Afa I.
3. Провести электрофорез продуктов рестрикции, проанализировать полученные электрофореграммы.
4. Провести анализ in silico ампликонов 500L - 1350R гена 16S-pPHK методом анализа ПДРФ с использованием данных GenBank, и построить теоретические электрофореграммы.
5. Сравнить теоретические и практические электрофореграммы. Сделать вывод о видовой принадлежности бактерий.
Работа выполнена на кафедре Медицинской биологии в Институте Фундаментальной Биологии и Биотехнологии.
