Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


Изучение времен жизни флуоресценции свободного целентерамида методом флуоресценции с временным разрешением

Работа №21277

Тип работы

Бакалаврская работа

Предмет

физика

Объем работы35
Год сдачи2017
Стоимость4900 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
209
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


РЕФЕРАТ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Люминесцентная спектроскопия 7
1.2 Метод флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением 10
1.3 Целентерамид-содержащие флуоресцентные белки (разряженные
фотопротеины) 12
1.4 Спектрально-люминесцентные и фотохимические свойства
целентерамида - флуорофора разряженных фотопротеинов 15
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 22
2.1. Реактивы 22
2.2 Приборы и установки 22
2.3. Регистрация спектров 23
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждения 25
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 30
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 31



Флуоресцентные белки широко применяются для решения большого круга практических задач медицины и биологии. Они используются для имиджинга клеточных структур и визуализации физиологических процессов в клетках. В настоящее время известно достаточно много флуоресцентных белков (например, зеленый флуоресцентный белок - GFP и его аналоги), характеризующихся различными флуоресцентными свойствами. Кроме GFP- подобных, к группе флуоресцентных белков относятся целентерамид- содержащие белки (разряженные фотопротеины), которые присутствуют в светящихся морских кишечнополостных (медузах Aequorea [1] и Phialidium (Clytia) [2], гидроидном полипе Obelia longissima [3] и др.). Их флуорофором является молекула целентерамида (ЦЛМ), связанная нековалентно с белком внутри его гидрофобной полости.
Известно, что спектры фотолюминесценции фотопротеинов широкие, ассиметричные и включают несколько компонент (эмиттеров), соответствующих различным формам ЦЛМ [4]. Под действием различных факторов соотношение компонент может меняться [5], а, следовательно, изменяться цвет флуоресценции. Для выявления физико-химических механизмов, лежащих в основе изменения цвета этих белков необходимо изучение флуоресцентных характеристик их флуорофора - ЦЛМ. В настоящее время, ведутся теоретические работы [6-10] по изучению электронных переходов в молекуле ЦЛМ с помощью квантово-химических методов. Проведены эксперименты с использованием спектроскопии с временным разрешением по изучению флуоресцентных свойств спектральных компонент фотолюминесценции разряженных фотопротеинов: обелина [11], акворина [11] и клитина [12]. Однако, в литературе нет экспериментальных данных по исследованию флуоресценции различных форм свободного ЦЛМ с помощью спектроскопии с временным разрешением.
Цель работы - проанализировать спектральные характеристики флуоресценции целентерамида при постоянном и импульсном возбуждении с временным разрешением.
Были поставлены следующие задачи:
1. Зарегистрировать спектры поглощения и флуоресценции целентерамида в метаноле при постоянном фотовозбуждении.
2. Зарегистрировать спад флуоресценции целентерамида с помощью метода флуоресцентной спектроскопии с наносекундным разрешением при различных длинах волн регистрации.
3. Проанализировать спад флуоресценции целентерамида. Определить: количество экспоненциальных компонент, их времена жизни и вклады при различных длинах волн регистрации.
4. Соотнести компоненты спада флуоресценции различным формам целентерамида.
Сочетание теоретических и экспериментальных данных обеспечит лучшее понимание природы фотофизических процессов, лежащих в основе изменения цвета флуоресценции как самих белков, так и их флуорофора - ЦЛМ. В дальнейшем это обеспечит возможность прогнозирования результатов токсического воздействия на ЦЛМ-содержащие флуоресцентные белки.


Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

Метод флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением впервые применен для изучения характеристик свободного целентерамида в метаноле. Выявлены две экспоненциальные компоненты в спаде флуоресценции целентерамида с временами жизни 3,25 нс и 1,68 нс. Восстановленные спектры флуоресценции этих двух форм характеризуются максимумами в интервалах 410-430 нм и 435-455 нм соответственно.
Две компоненты в спаде флуоресценции целентерамида приписаны двум эмиттерам, которые соответствуют протонированной (1,68 нс) и депротонированной (3,25 нс) формам целентерамида.



1. Shimomura, O. Chemical nature of bioluminescence systems in
coelenterates / O. Shimomura, F.H. Johnson // PNAS USA. - 1975. - V. 72 (4).
- P. 1546-1549. 121.
2. Levine, L. D. Isolation and characterization of a photoprotein “phialidin” and a spectrally unique green-fluorescent protein from the bioluminescent jellyfish Phialidium gregarium / L. D. Levine, W. W. Ward // Comp. Bochem. Physiol. - 1982. - V. 72. - P. 77-85.
3. Высоцкий, Е. С. Выделение и очистка Са2+-зависимого
фотопротеина - обелина из гидроидных полипов Obelia longissima / Е. С. Высоцкий, В. С. Бондарь, В. Н. Летунов // Биохимия. - 1989. - Т. 54. - С. 965-973. 7
4. Shimomura, O. Light-emitters involved in the luminescence of
coelenterazine / O. Shimomura, K. Teranishi // Luminescence. - 2000. - V. 15.
- Р. 51-58
5. Алиева, Р. Р. Влияние внешних физико-химических факторов на спектрально-люминесцентные свойства разряженного фотопротеина обелина: дис. ... канд. биол. наук: 03.01.02 / Алиева Роза Ришатовна. - Красноярск, 2016. - 120 с.
6. Liu, Z.J. Structure of the Ca2+ - regulated photoprotein obelin at 1.7 A resolution determined directly from its sulfur substructure / Z.J. Liu, E.S. Vysotski, C.J. Chen, J.P. Rose, J. Lee, B.C. Wang // J. Protein Science, 2000. - V. 9, N 11. - Р. 2085-2093.
7. Liu, Z. J. Crystal structure of obelin after Ca2+-triggered bioluminescence suggests neutral coelenteramide as the primary excited state / Z. J. Liu, G. A. Stepanyuk, E. S. Vysotski, J. Lee, S. V. Markova, N. P. Malikova, B. C. Wang // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2006. - V. 103. - P. 2570-2575.
8. Chen, R. F. Fluorescence quantum yield of tryptophan and tyrosine / R. F. Chen // Analytical Letters. - 1967. - V.1 - P. 35-42.
27
9. Chen, S.-F. Chemiluminescence of coelenterazine and fluorescence of coelenteramide: a systematic theoretical study / S.-F. Chen, I. Navizet, D. RocaSanjua, R. Lindh, Y.-J. Liu, N. Ferre // J. Chem. Theory Comput. - 2012. - V. 8. - P. 2796-2807.
10. Alieva, R. R. Ultraviolet fluorescence of coelenteramide and coelenteramide containing fluorescent proteins. Experimental and theoretical study / R. R. Alieva, F. N. Tomilin, A. A. Kuzubov, S. G. Ovchinnikov, N. S. Kudryasheva // Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology. - 2016. - V. 162. - P. 318-323.
11. Laptenok, S. P. Disentangling picosecond events that complicate the quantitative use of the calcium sensor YC3. 60 / S. P Laptenok., I.H. van Stokkum, J.W. Borst, B. van Oort, A.J. Visser, H. van Amerongen // The Journal of Physical Chemistry B. - 2012. - Т. 116. - №. 9. - С. 3013-3020.
12. Malikova, N. P. Green-fluorescent protein from the bioluminescent jellyfish Clytia gregaria is an obligate dimer and does not form a stable complex with the Ca2+-discharged photoprotein clytin / N. P. Malikova, N. V. Visser, A. van Hoek, V. V. Skakun, E. S. Vysotski, J. Lee, A. J. W. G. Visser // Biochemistry. - 2011. - Т. 50. - №. 20. - С. 4232-4241.
13. Юков, Е. А. Спектроскопия // Физическая энциклопедия / Гл. ред. А. М. Прохоров. — М.: Большая Российская энциклопедия, 1994. — Т. 4. — С. 625.
14. Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии / Дж. Лакович; пер. с англ. под редакцией М. Г. Кузьмина. - Москва: Мир, 1986. - 496 с.
15. Кудряшева, Н. С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа: учеб. пос. / Н. С. Кудряшева, В. А. Кратасюк, Е. Н. Есимбекова. - Красноярск: КГУ, 2002. - 154 с.
16. Высоцкий, Е. С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е. С. Высоцкий, С. В. Маркова, Л. А. Франк // Молекулярная биология. - 2006. - Т. 40, № 3. - С. 404-417.
17. Allen, D. G. Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration - a calcium independent component / D. G. Allen, J. R. Blinks, F. G. Prendergast // Science. - 15. - V. 195. - P. 996-998.
18. Deng, L. All three Ca2+-bindung loops of photoproteins bind calcium ions: The crystal structures of calcium-loaded apo-aequorin and apo-obelin / L. Deng, E. S. Vysotski, S. V. Markova, Z. J. Liu, J. Lee, J. Rose, B. C. Wang // J. Protein Science. - 2005. - V. 14. - P. 663-675.
19. Strynadka, N. C. J. Crystal structures of the helix-loop-helix calciumbinding proteins / N. C. J. Strynadka, M. N. G. James // Annu. Rev. Biochem. - 1989. - V. 58. - P. 951-998.
20. Girotti, S. Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria / S. Girotti, E. N. Ferri, M. G. Fumo, E. Maiolini // Analytica Chimica Acta. - 2008. - V. 608 (1). - P. 2-29. doi: 10.1016/j.aca.2007.12.008.
21. Ugarova, N. N. Bioluminescence spectra of native and mutant firefly luciferases as a function of pH / N. N. Ugarova, L. G. Maloshenok, I. V. Uporov, M. I. Koksharov // Biochemistry (Moscow). - 2005. - V. 70. - I. 11. - Р. 1262-1267.
22. Исмаилов, А. Д. Фотобиосенсоры на основе светящихся бактерий / А. Д. Исмаилов, Л. Э. Алескерова // Биохимия. - 2015. - Т. 80, № 6. - С. 867-881.
23. Ломакина, Г. Ю. Биолюминесцентная детекция жизнеспособности клеток / Г. Ю. Ломакина, Ю. А. Модестова, Н. Н. Угарова // Биохимия. - 2015. - Т. 80, № 6. - С. 829-844.
24. Efremenko, E. N. Biosensitive element in the form of immobilized luminescent photobacteria for detecting ecotoxicants in aqueous flow-through systems / E. N. Efremenko, O. V. Maslova, A. V. Kholstov, O. V. Senko, A. D. Ismailov // Luminescence: the journal of biological and chemical luminescence. - 2016. - V. 31, № 6. - P. 1283-1289.
25. Kratasyuk, V. A. Applications of luminous bacteria enzymes in toxicology / V. A. Kratasyuk, E. N. Esimbekova // Combinatorial chemistry & high throughput screening. - 2015. - V. 18 (10). - P. 952-959.
26. Illarionov, B. A. Recombinant obelin: Cloning and expression of cDNA, purification, and characterization as a calcium indicator / B. A. Illarionov, L. A. Frank, V. A. Illarionova, V. S. Bondar, E. S. Vysotski, J. R. Blinks // Methods of enzymology. - 2000. - V. 305. - P. 223-249.
27. Campbell, А. К. Coelenteratephotoproteins as indicators of cytoplasmic free Са2+ in small cells / А. К. Campbell, R. L. Dormer, М. В. Hallet // Cell Calcium. - 1985. - V. 6. - P. 69-82.
28. Бондарь, В. С. Получение, свойства и применение кальций- чувствительного фотопротеина из гидроида Obelia longissima / В. С. Бондарь, Е. С. Высоцкий, И. А. Гамалей, А. Б. Каулин // Цитология. - 1990.
- T. 33. - C. 57-66.
29. Markova, S. V. Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning, expression, and comparison of some properties with those of other Ca2+regulated photoproteins / S. V. Markova, E. S. Vysotski, J. R. Blinks, L. P. Burakova, B.-C. Wang, J. Lee // Biochemistry. - 2002. - V. 41. - P. 2227-2236.
30. Kendall, J.M. Engineering the Cа2+-activated photoprotein aequorin with reduced affinity for calcium / J. M. Kendall, G. Sala-Newby, V. Ghalaut, R. L. Dormer, A. K. Campbell // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1992. - V. 187.
- P. 1091-1097.
31. Zhao, Y. CcbP, a calcium-binding protein from Anabaena sp. PCC 7120, provides evidence that calcium ions regulate heterocyst differentiation / Y. Zhao, Y. Shi, W. Zhao, X. Huang, D. Wang, N. Brown, J. Brand, J. Zhao // PNAS USA. - 2005. - V. 102. - P. 5744-5748.
32. Belogurova, N. V. Discharged photoprotein obelin: fluorescence
peculiarities / N. V. Belogurova, N. S. Kudryasheva // Journal of photochemistry and photobiology. B. - 2010. - V. 101. - P. 103-108.
33. Франк, Л. А. Синтез конъюгантов Са2+-регулируемого фотопротеина обелина с иммуноглобулинами и их использование в качестве меток в иммуноанализе / Л. А. Франк, А. И. Петунин, Е. С.
Высоцкий // Биоорганическая химия. - 2004. - Т. 30, № 4. - С. 364-368.
34. Frank, L. A. Ca2+-Regulated Photoproteins: Effective Immunoassay Reporters / L. A. Frank // Sensors. - 2010. - V. 10. - P. 11287-1130.
35. Борисова, В. В. Высокочувствительный и быстрый метод выявления ДНК фрагментов с использованием фотопротеина обелина как репортера /
В. В. Борисова, И. А. Пышная, Д. В. Пышный, Л. А. Франк // Биоорганическая химия. - 2008. - Т. 34, № 6. - С. 792-798.
36. Eremeeva, E. V. Ca2+-regulated photoprotein obelin as N-terminal partner in the fusion proteins / E. V. Eremeeva, L. A. Frank, S. V. Markova, E. Vysotski // Journal of Siberian Federal University. Biology. - 2010. - V. 4. - P. 372-383.
37. Красицкая, В. В. Выявление аллельных вариантов гена с помощью биолюминесцентных репортеров / В. В. Красицкая, Л. П. Буракова, И. А. Пышная, Л. А. Франк // Биоорганическая химия. - 2012. - Т. 38, №3. - С. 342350.
38. Gorokhovatsky, A.Y. Fusion of Aequorea victoria GFP and aequorin provides their Ca(2+)-induced interaction that results in red shift of GFP absorption and efficient bioluminescence energy transfer / A.Y. Gorokhovatsky, V.V. Marchenkov, N.V. Rudenko, T.V. Ivashina, V.N. Ksenzenko, N. Burkhardt, G.V. Semisotnov, L.M. Vinokurov, Y.B. Alakhov // Biochemical and biophysical research communications. - 2004. - Т. 320. - №. 3. - С. 703-711.
39. Rodriguez-Garcia, A. GAP, an aequorin-based fluorescent indicator for imaging Ca2+ in organelles / Rodriguez-Garcia, J. Rojo-Ruiz, P. Navas-Navarro, F.J. Aulestia, S. Gallego-Sandin, J. Garcia-Sancho, M. T. Alonso // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2014. - Т. 111. - №. 7. - С. 2584-2589.
40. Bakayan, A. Fluorescent protein-photoprotein fusions and their applications in calcium imaging / A. Bakayan, B. Domingo, C.F. Vaquero, N. Peyrieras, J. Llopis // Photochemistry and Photobiology. - 2016. - T. 93. - №.
2. - С. 448-465.
41. Baubet, V. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level / V. Baubet, M.H. Le, A.K. Campbell, E.
Lucas-Meunier, P. Fossier, P. Brule // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2000. - Т. 97. - №. 13. - С. 7260-7265.
42. Saito, R. Solvent and substituent effects on the fluorescent properties of coelenteramide analogues / R. Saito, T. Hirano, H. Niwa, M. Ohashi // Journal of the chemical society, Perkin transactions 2. - 1997. - P. 1711-1716.
43. Imai, Y. Fluorescence properties of phenolate anions of coelenteramide analogues: the light-emitter structure in aequorin bioluminescence / Y. Imai, T. Shibata, S. Maki, S. Niwa, M. Ohashi, T. Hirano // Photochem. Photobiol. A. - 2001. - V. 146. - P. 95-107.
44. Alieva, R. R. Ultraviolet fluorescence of coelenteramide and coelenteramidecontaining fluorescent proteins. Experimental and theoretical study / R. R. Alieva, F. N. Tomilin, A. A. Kuzubov, S. G. Ovchinnikov, N. S. Kudryasheva // Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology. - 2016.
- V. 162. - P. 318-323.
45. McCapra, F. The chemiluminescence of Cypridina analogue / F. McCapra, Y. C. Chang // Chem. Commun. - 1967. - P. 1011-1012.
46. Hori, K. Chemiluminescence of Renilla (sea pansy) luciferin and its analogues / K. Hori, J. E. Wampler, M. J. Cormier // J. Chem. Commun. - 1973.
- P. 492-494.
47. Shimomura, O. Bioluminescence in the sea: photoprotein systems / O. Shimomura // J. Symp. Soc. Exp. Biol. - 1985. - V. 39. - Р. 351-422.
48. Deng, L. Structural basis for the emission of violet bioluminescence from a W92F obelin mutant / L. Deng, E. S. Vysotski, Z. J. Lui, S. V. Markova, N. P. Malikova, J. Lee, J. Rose, B. C. Wang // J. FEBS Letters. - 2001. - V. 506. - Р. 281-285.
49. Vysotski, E. S. Violet bioluminescence and fast kinetics from W92F obelin: structure-based proposals for the bioluminescence triggering and the identification of the emitting species / E. S. Vysotski, Z. J. Liu, S. V. Markova,
J. R. Blinks, L. Deng, L. A. Frank, M. Herko, N. P. Malikova, J. P. Rose, B. C. Wang, J. Lee // Biochemistry. - 2003. - V. 42. - P. 6013-6024.
50. Ohmiya, Y. Two excited states in aequorin bioluminescence induced by tryptophan modification / Y. Ohmiya, M. Ohashi, F. I. Tsuji // FEBS Lett. - 1992. - V. 301. - P. 197-201.
51. Vysotski, E. S. Ca2+-regulated photoproteins: structural insight into the bioluminescence mechanism / E. S. Vysotski, J. Lee // Acc. Chem. Res. - 2004. - V. 37. - P. 405-415.
52. Tomilin, F. N. Fluorescence of calcium-discharged obelin: The structure and molecular mechanism of emitter formation / F. N. Tomilin, L. U. Antipina, E. S. Vysotski, S. G. Ovchinnikov, I. I. Gitelzon // Dokl. Biochem. Biophys. - 2008. - V. 422. - P. 279-284
53. Антипина, Л. Ю. Теоретическое моделирование процесса флуоресценции и формирование излучающего субстрата белка обелина / Л. Ю. Антипина, С. Г. Овчинников // В мире научных открытий, Физикоматематические науки. - 2010. - № 5 (11). - С. 35-37.
54. Turro, N. J. Modern molecular photochemistry / N. J. Turro. - California: University science book, 1991. - 620 p.
55. Malikova, N. P. Spectral tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92 / N. P. Malikova, G. A. Stepanyuk, L. A. Frank, S. V. Markova, E. S. Vysotski, J. Lee // FEBS Letters. - 2003. - № 554. - P. 184-188.
56. Stepanyuk, G. A. Interchange of aequorin and obelin bioluminescence color is determined by substitution of one active site residue of each photoprotein / G. A. Stepanyuk, S. Golz, S. V. Markova, L. A. Frank, J. Lee, E. S. Vysotski E.S. // FEBS Lett. - 2005. - V. 579. - P. 1008-1014

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.




©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.