ВВЕДЕНИЕ 3
1 Основная часть 6
1.1 Некодирующие РНК 6
1.1.1 МикроРНК и механизмы регуляции экспрессии мРНК 8
1.2 Секвенирование РНК (RNA-seq) 10
1.3 Алгоритмические подходы 12
1.3.1 Сборка RNA-Seq данных 12
1.3.2 In silicoпредсказание микроРНК и их мишеней 15
2 Материалы и методы 18
3 Результаты и обсуждения 20
3.1 Результаты ассемблирования 20
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 30
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 31
Актуальность проблемы. В последнее десятилетие во многих областях биологии произошли серьезные изменения, в частности, претерпела преобразование и молекулярная биология РНК. Одним из наиболее значимых достижений в данной области стало обнаружение некодирующих белок РНК, способных регулировать экспрессию генов на посттранскрипционном и посттрансляционном уровнях. Было также показано, что подавляющее число молекул РНК в клетке представляют собой именно эту группу РНК, в то время как кодирующие белок последовательности, в зависимости от организма, составляют всего 1-3% от суммарного количества РНК в клетке [1, 2].
Некодирующие РНК способны регулировать метаболические пути, ассоциированные с онтогенезом, дифференциацией клеток, а также связанные с ответом на абиотические и биотические стресс-факторы окружающей среды [3¬5]. Кроме того, имеются данные о том, что микроРНК (миРНК, один из классов некодирующих РНК) играет особую роль в межвидовой коммуникации [6]. Было показано, что подобная связь на молекулярном уровне между миРНК патогена и организмом хозяина может играть ключевую роль в развитии болезни путем репрессии большого количества защитных генов хозяина [7, 8]. С данным классом молекул связан также один из возможных механизмов патогенности грибов.
Многие заболевания растений, вызванные грибами, могут протекать в скрытой форме, поэтому, после инвазии возбудителя, лечение зараженных деревьев практически невозможно. Затруднено это также и из-за способа передачи патогена: грибной патоген распространяется через корневые контакты деревьев и сохраняет способность к инфицированию в течение десятилетий, что часто приводит к повторному заражению саженцев и молодых растений, которые через несколько лет погибают [9]. Изменения климатических условий и интенсивная лесозаготовка приводят еще к большему распространению возбудителя, что, в свою очередь, наносит огромный экономический урон для лесной промышленности. Поэтому очень важно изучить механизм патогенности этих видов. Одним из популярных методов для изучения регуляции экспрессии генов и регуляторных механизмов клетки и организма в целом является секвенирование РНК и анализ транскриптома (совокупности всей РНК организма, представляющей экспрессируемую часть генома - экзом).
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы стали de novo сборка тотального транскриптома лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и поиск таргетных последовательностей для различных микроРНК в полученной сборке: консервативных миРНК, опубликованных в базе данных miRBase, а также миРНК одного из наиболее патогенных грибов Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Snyder et. Hansen.
Для достижения данной цели, были поставлены следующие задачи:
- осуществить de novoсборку тотального транскриптома лиственницы сибирской;
- провести оценку полученного транскриптома;
- осуществить поиск и анализ таргетов для консервативных миРНК, опубликованных в базе данных miRBase;
- осуществить поиск и анализ таргетов для миРНК Fusarium oxysporum.
Научная новизна. Впервые проведена de novoсборка тотального транскриптома лиственницы сибирской. Впервые определены основные таргеты в полученном транскриптоме для консервативных миРНК, а также для миРНК патогенного гриба F. oxysporum.Установлено, что многие таргеты ассоциированы с ответом на биотический стресс, в частности, с ответом на воздействие патогена.
Практическая значимость. Данное исследование имеет важное значение для лесной геномики и лесного хозяйства, так как полученные результаты могут быть применены в разработке природоохранных мероприятий и позволят решить вопросы, связанные с массовой гибелью лесов вследствие воздействия различных патогенов. Результаты данной работы смогут помочь в разработке молекулярно-генетических методик для укрепления защитных механизмов деревьев против возбудителей заболеваний, а также могут быть использованы для дальнейшего изучения подходов для раннего выявления инфекции.
Апробация работы. Результаты данной работы будут представлены на 11-ой Международной мультиконференции по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure Systems Biology — BGRSSB-2018).
Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность Н.В. Орешковой за пробоподготовку и секвенирование, В.В. Шарову за предварительную обработку данных секвенирования, а также руководителю Лаборатории лесной геномики К.В. Крутовскому, научному руководителю М.Г. Садовскому и руководителю биоинформатической группы Ю.А. Путинцевой за обсуждение результатов, ценные указания и советы в проведении исследования.
Магистерская диссертация выполнена в лаборатории лесной геномики СФУ и базовой кафедры защиты и современных технологий мониторинга лесов (зав. каф. д.б.н. И. Е. Ямских) в рамках проекта «Геномные исследования основных бореальных лесообразующих хвойных видов и их наиболее опасных патогенов в Российской Федерации», руководимого проф. К. В. Крутовским и финансируемого Правительством РФ (договор №14.Y26.31.0004).
В ходе данной исследовательской работы были выполнены все поставленные задачи, а именно:
- Проведена очистка данных секвенирования от рибосомальной РНК и осуществлена de novoсборка транскриптомов хвои, побега 1 года, камбия и проростка лиственницы сибирской, а также впервые получен тотальный транскриптом данного вида. Длина тотального транскриптома составила 412382049 н.о. (244222634 н.о. с учетом только самых длинных изоформ для каждого юнигена).
- Произведена оценка полученных данных. Набор транскриптов, включающий в себя только самые длинные изоформы каждого юнигена, оказался наиболее подходящим для дальнейшего анализа - он является наиболее завершенным (72,1%) с низким уровнем дупликаций (3,8%).
- Определены таргеты для консервативных миРНК, опубликованных в базе данных miRBase. Установлено, что основными таргетами являются транскрипционные факторы, участвующие в ответе растения на биотический и абиотический стрессы, а также большое количество найденных таргетов соответствует гипотетическим неохарактеризованным белкам, что указывает на пока ещё плохо изученные функции данных таргетов.
- Определены гены-мишени для миРНК патогенного гриба Fusarium oxysporum.Большинство таргетов ассоциировано с белками, ответственными за ответ растения на воздействие патогенов. Также показано, что ослабление защитных механизмов путем РНК-интерференции может быть характерно не только для F. oxysporum,но и для других патогенных грибов.
Таким образом, поставленные в магистерской диссертации цель и задачи полностью достигнуты.
