Введение 3
1 Обзор литературы 5
1.1 Характеристика ПГА 5
1.2 Биосинтез ПГА 6
1.3 Мономерные звенья в полимерах 6
1.3.1 3ГБ мономер 7
1.3.2 4ГБ мономер 7
1.4 Сополимер П(3ГБ-со-4ГБ) 8
1.5 Получение сополимера П(3ГБ-со-4ГБ) 9
1.5. 1 Использование разных предшественников 9
1.5.2 Использование смеси субстратов 10
1.5.3 Использование мутантных штаммов 12
1.6 Синтнез и свойства П(3ГБ-со-3ГВ-со-4ГБ) 13
2 Материалы и методы 15
2.1 Культивирование бактерий 15
2.2 Измерение параметров процессов 15
2.3 Определение содержания е-капролактона в среде 15
2.4 Анализ структуры ПГА 16
2.5 Анализ молекулярного веса ПГА 16
2.6 Изготовление плёнок 16
2.7 Определение поверхностных свойств плёнок 16
4 Выводы 28
5 Список используемых источников 29
Полигидроксиалканоаты (ПГА) - термопластические полиэфиры,синтезируемые различными бактериями в качестве внутриклеточного запасного материала в условиях лимитирования роста питательными элементами (например, азотом, фосфором) и при избыточном содержании источника углерода. В последние годы изучению ПГА уделяется огромное внимание благодаря их потенциальному применению в различных областях - медицине, фармакологии, сельском и коммунальном хозяйстве, пищевой и косметической промышленности, радиоэлектронике и других сферах, так как по сравнению с обычными пластиками, получаемыми из нефти, ПГА разрушаются в аэробных/анаэробных условиях и являются биосовместимыми материалами.
Наиболее изученным является поли-3-гидроксибутират, но помимо П3ГБ, перспективны также и сополимерные ПГА, которые в зависимости от набора и соотношения мономеров имеют различные базовые свойства (степень кристалличности, температуры плавления и термической деградации, пластичность, механическую прочность и др.).
Наиболее распространенный мономер, полимеризующийся большинством ПГА-синтаз, является 3-гидроксимасляная кислота (3ГБ). Однако в результате, П3ГБ гомополимер имеет ограничения из-за жестких и хрупких свойств. Поэтому исследователи сосредоточили внимание на изучении ПГА сополимеров, содержащих такие мономеры, как 4-гидроксибутират (4ГБ), для создания различных типов ПГА с разными физико-химическими свойствами и широкими возможностями применения.
Различные виды ПГА могут быть произведены при включении различных мономерных единиц, и это зависит от используемого субстрата. От выбора предшественника зависит не только выход мономеров в полимере, но и зачастую накопление биомассы. В данной работе был впервые использован в качестве предшественника 4ГБ е-капролактон.
Сополимер П(3ГБ-со-4ГБ) является одним из биополимеров, который был признан многообещающим биоматериалом в медицине и фармацевтической промышленности. Это объясняется главным образом присутствием 4-гидроксибутирата (4ГБ) мономера, поскольку данный мономер не вызывает воспалительных реакций в тканях и способен повысить общую биосовместимость этих сополимеров.
Цель работы: Исследование роста бактерий Cupriavidus eutrophus B- 10646 и синтез полимера, содержащего 4-гидроксибутират.
Задачи:
1. Исследовать накопление биомассы и полимера бактериями С. eutrophus B-10646 в присутствии различных концентраций е-капролактона, как субстрата для синтеза мономеров 4-гидроксибутирата.
2. Исследовать накопление биомассы и полимера бактериями С. eutrophus B-10646 в присутствии валерата калия, как субстрата для синтеза мономеров 3-гидроксивалерата.
3. Изучить свойства двухкомпонентных поли(3-гидроксибутират/4- гидроксибутират) и трехкомпонентных поли(3-гидроксибутират/3-гидроксивалерат/4гидроксибутират) при росте на е-капролактоне и валерате калия.
1. Исследовано влияние е-капролактона в концентрациях 1-5 г/л на рост биомассы и синтез полимера. Показано, что концентрация е-капролактона выше 2 г/л ингибирует рост бактерий, однако не влияет на накопление полимера.
2. Показано, что дробная подача е-капролактона приводит к увеличению содержания 4ГБ мономера в сополимере. Максимальное содержание 4ГБ мономера составило 21,4% при общей концентрации капролактона 6 г/л.
3. Добавление валерата калия (1-2 г/л) и е-капролактона (4 г/л) приводит к синтезу трехкомпонентного полимера с содержанием 3ГВ (7-15%) и 4ГБ (21-23%).
4. Исследованы молекулярная масса и поверхностные свойства полимеров различного состава. Отмечено снижение молекулярной массы у сополимеров, содержащих 4ГБ.
5. Температуры плавления, стеклования и кристаллизации у двух- и трехкомпонентных полимеров ниже, чем у гомополимера П3ГБ. Температура деградации же практически не изменялась.
6. С увеличением содержания 4ГБ мономера увеличивается гидрофильность поверхностей плёнок двухкомпонентных полимеров. У плёнок трехкомпонентных полимеров гидрофильность выше там, где одновременно высокое содержание 4ГБ и низкое содержание 3ГВ.
1. Прудникова, С. В. Экологическая роль полигидроксиалканоатов - аналога синтетических пластмасс: закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами / С. В. Прудникова, Т. Г. Волова. - Красноярск: Красноярский писатель, 2012. - 184 с.
2. Higuchi-Takeuchi, M. Synthesis of High-Molecular-Weight Polyhydroxyalkanoates by Marine Photosynthetic Purple Bacteria / Mieko Higuchi- Takeuchi, Kumiko Morisaki, Kiminori Toyooka ,Keiji Numata // JOURNAL PLOS ONE. - 2016. №10. P. 1-17.
3. Miguel, D. Fed-Batch Synthesis of Poly(3-Hydroxybutyrate) and Poly(3- Hydroxybutyrate-co-4-Hydroxybutyrate) from Sucrose and 4-Hydroxybutyrate Precursors by Burkholderia sacchari Strain DSM 17165 / Miranda de Sousa Dias Miguel, Martin Koller, Dario Puppi, Andrea Morelli, Federica Chiellini, Gerhart Braunegg // Bioengineering. - 2017. - Vol. 36
4. Kalacheva, G. S. Fatty Acid Composition of Wautersia eutropha Lipids under Conditions of Active Polyhydroxyalkanoates Synthesis / G. S. Kalacheva, T. G. Volova // Microbiology. - 2007. V. 76. No.5. P. 535-540.
5. Muzaiyanah, A. R. Studies on the Microbial Synthesis and Characterization of Polyhydroxyalkanoates Containing 4-Hydroxyvalerate Using у-Valerolactone/ A. R. Muzaiyanah, A. A. Amirul // Biochemist Biotechnology - 2013. V. 170. P. 1194¬1215.
6. Волова, T. Г. Синтез Сополимеров 3-гидроксибутирата-Со-4- гидроксибутирата водородокисляющими бактериями / Т. Г Волова, Н. О. Жила, Г. С. Калачёва, В. А. Соколенко Прикладная биохимия и микробиология -2011. Т. 47. С. 544-550.
7. Виноградова, О.Н. Микробиологический синтез и свойства П(3ГБ/4ГБ) с высоким включением фракции 4ГБ / О. Н. Виноградова // Актуальная биотехнология - 2015. Т3. С. 38.
8. Tran, P. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) and its copolymers by Yangia sp.NP199 from different carbon sources / Huu Phong Tran, Doan Van Thuoc, Kumar Sudes // International Journals of Biological Macromolecules. - 2016. V.84. P. 361-366.
9. Cavalheiro, M. Effect of cultivation parameters on the production of poly(3- hydroxybutyrate-co-4- hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-4- hydroxybutyrate-3- hydroxyvalerate) by Cupriavidus necator using waste glycerol / M. Cavalheiro, R. Raposo, M. Catarina, C. Servin // Bioresource Technology. - 2012. P. 1-7.
10. Iqbal, N. Synthesis of P(3HB-co-4HB) copolymer with target¬specific 4HB molar fractions using combinations of carbon substrates / Nurhezreen Md. Iqbal, A. A. Amirul // Research Article. - 2013.
11. Huong, K. Microbial-based synthesis of highly elastomeric biodegradable poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) thermoplastic / Kai-Hee Huong, Chin-Hoe Teh, Amirul Al-Ashraf Abdullah // International Journal of Biological Macromolecules. - 2017. V. 17.
12. Shishatskaya, E. I. A comparative investigation of biodegradable polyhydroxyalkanoate films as matrices for in vitro cell cultures. / E. I. Shishatskaya, T. G. Volova // J. Mater. Sci. Mater. Med. - 2004. V. 15. P. 915-923.
13. Huong, K. Biosynthetic enhancement of single-stage Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) production by manipulating the substrate mixtures / Kai-Hee Huong, Shantini Kannusamy, Sumithda Yeong Hui Lim, A. A. Amirul // Journal Indi Microbial Biotechnology. - 2015. V. 42. P. 1291¬1297.
14. Gorenflo, V. Development of a process for the biotechnological large-scale production of 4-hydroxyvalerate-containing polyesters and characterization of their physical and mechanical properties / V. Gorenflo, G. Schmack, R. Vogel, A. Steinbuchel // Biomacromolecules. - 2001. V. 2. P. 45 -57.
15. Lee-Mei, Ng. Identification of a new polyhydroxyalkanoate (PHA) producer Aquitalea sp. USM4(JCM 19919) and characterization of its PHA synthase / Lee-Mei Ng, Kumar Sudesh // Journal of Bioscience and Bioengineering. - 2016. V. 122. N. 5. P. 550-557.
16. Ramachandran, H. Bioconversion of Glycerine Pitch into a Novel Yellow- Pigmented P(3HB-co-4HB) Copolymer: Synergistic Effect of Ammonium Acetate and Polymer Characteristics / H. Ramachandran, A. A. Amirul // Appl Biochemist Biotechnology. - 2014. №172. P. 891-909.
17. Martin, D.P., Williams S.F. // Journal of Bioscience and Bioengineering 2003. V. 16. № 2. P. 97-105.
18. Ishak, S. Synthesis of high 4-hydroxybutyrate copolymer by Cupriavidus sp. Transformants using one-stage cultivation and mixed precursor substrates strategy / Muhammad Syafid Ishak, Kai-Hee Huong, K. Shantini, S. Vigneswari// Journal Enzyme and Microbial Technology. - 2017. V.98. P. 1-7.
19. Li Z.-J. / Metabolic Engineering // Li Z.-J., Shi Z.-Yu, J. Jian, Y.-Y. Guo, Q. Wu, G.-Q. Chen// -2010. V. 12. №4. P. 352-359
20. Chee, J. W. The Influence of Copolymer Ratio and Drug Loading Level on the Biocompatibility of P(3HB-co-4HB) Synthesized by Cupriavidus sp. USMAA2- 4./ J. W. Chee, A. A. Amirul, Tengku Muhammad, S. M. Mansor // Biochemist Engineering Journal. - 2008. V. 38. P. 314-318.
21. Wu, H. Strategies for Combating Bacterial Biofilm Infections./ H. Wu, C. Moser, H. Z. Wang, Z. J. Song // International Journal Oral Sci. - 2015. V. 7. P. 1¬7.
22. Iszatty, I. Enhanced production of poly(3-hydroxybutyrateco-4- hydroxybutyrate) copolymer and antimicrobial yellow pigmentation from Cupriavidus sp. USMAHM13 with antibiofilm capability / Ismail Iszatty, Tana Poorani Gurusamy, Hema Ramachandran, Abdullah AlAshraf Amirul // Preparative Biochemistry and Biotechnology. - 2017. V. 10.
23. Волова, Т. Г. Биомедицинский потенциал разрушаемых полигидроксиалканоатов: экспериментально-клинические исследования / Т. Г. Волова [и др.]. - Красноярск: Версо, - 2014. -332 с.
24. Fahima Azira, T. M. Biosynthesis of Poly(3-hydroxybutyrate-co-3- hydroxyvalerate-co4-hydroxybutyrate) terpolymer by Cupriavidus sp. USMAA2-4 through two-step
cultivation process / T. M. Fahima Azira, A. A. Nursolehah, Y. Norhayati // World J Microbiol Biotechnol. - 2010. V. 7.
25. Lee, W. H. Effects of culture conditions on the composition of poly(3- hydroxybutyrate-co-4hydroxybutyrate) synthesized by Comamonas acidovorans. / W. H. Lee, N. M. Azizan, K. Sudesh // Polym. Degrad. Stab. - 2004. V. 84. P. 129¬134.
26. Suchada, C. Production and Characterization of Biodegradable Terpolymer Poly(3-Hydroxybutyrate-co-3-Hydroxyvalerate-co4-Hydroxybutyrate) by Alcaligenes sp. A-04 / Suchada Chanprateep, Songsri Kulpreecha // JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING. - 2006. V. 101. №1. P. 51-56