Адресная противоопухолевая терапия с использованием магнитных наночастиц и ДНК аптамеров
|
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Свойства магнитных наночастиц 7
1.2 Размер и форма магнитных наночастиц 8
1.3 Методы синтеза магнитных наночастиц 9
1.4 Поверхностные модификации магнитных наночастиц 13
1.5 Способы доставки магнитных наночастиц к поверхности опухолевых
клеток 16
1.6 Доставка магнитных наночастиц в опухолевые клетки 17
1.7 Фармакокинетика и биораспределение магнитных наночастиц 18
1.8 Понятие аптамеров 20
1.9 Терапия опухолевых заболеваний с применением коньюгатов
магнитных наночастиц с ДНК-аптамерами 21
1.9.1 Адресная доставка лекарственных средств коньюгатами магнитных
наночастиц с ДНК-аптамерами 21
1.9.2 Магнитная гипертермия 23
1.9.3 Магнитомеханическое разрушение опухолевых клеток 24
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 26
2.1 Объекты исследований 26
2.2 Функционализация покрытых золотом магнитных наночастиц ДНК-
аптамерами 27
2.3 Магнитодинамическая нанотерапия in vitro 27
2.4 Анализ воздействий магнитных наночастиц покрытых золотом в
низкочастотном переменном магнитном поле in vitro 27
2.5 Магнитодинамическая терапия in vivo 28
2.6 Активность каспазы в опухолевых тканях 29
2.7 Гистологический анализ 29
2.8 Исследование токсичности Au-МНЧ in vivo 29
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 31
3.1 Оптимизация условий магнитодинамической терапии 31
3.2 Исследование биологического эффекта функционализированных ДНК-
аптамерами магнитных наночастиц (AS14-Au-MH4) в переменном электромагнитном поле in vivo 32
3.3 Исследование механизма гибели опухолевых клеток с помощью
магнитодинамической терапии 34
3.4 Исследование токсичности Au-МНЧ in vivo 40
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 42
ВЫВОДЫ: 44
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 45
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Свойства магнитных наночастиц 7
1.2 Размер и форма магнитных наночастиц 8
1.3 Методы синтеза магнитных наночастиц 9
1.4 Поверхностные модификации магнитных наночастиц 13
1.5 Способы доставки магнитных наночастиц к поверхности опухолевых
клеток 16
1.6 Доставка магнитных наночастиц в опухолевые клетки 17
1.7 Фармакокинетика и биораспределение магнитных наночастиц 18
1.8 Понятие аптамеров 20
1.9 Терапия опухолевых заболеваний с применением коньюгатов
магнитных наночастиц с ДНК-аптамерами 21
1.9.1 Адресная доставка лекарственных средств коньюгатами магнитных
наночастиц с ДНК-аптамерами 21
1.9.2 Магнитная гипертермия 23
1.9.3 Магнитомеханическое разрушение опухолевых клеток 24
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 26
2.1 Объекты исследований 26
2.2 Функционализация покрытых золотом магнитных наночастиц ДНК-
аптамерами 27
2.3 Магнитодинамическая нанотерапия in vitro 27
2.4 Анализ воздействий магнитных наночастиц покрытых золотом в
низкочастотном переменном магнитном поле in vitro 27
2.5 Магнитодинамическая терапия in vivo 28
2.6 Активность каспазы в опухолевых тканях 29
2.7 Гистологический анализ 29
2.8 Исследование токсичности Au-МНЧ in vivo 29
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 31
3.1 Оптимизация условий магнитодинамической терапии 31
3.2 Исследование биологического эффекта функционализированных ДНК-
аптамерами магнитных наночастиц (AS14-Au-MH4) в переменном электромагнитном поле in vivo 32
3.3 Исследование механизма гибели опухолевых клеток с помощью
магнитодинамической терапии 34
3.4 Исследование токсичности Au-МНЧ in vivo 40
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 42
ВЫВОДЫ: 44
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 45
Онкологические заболевания остаются одной из главных причин смертности в мире. Несмотря на успехи в понимании молекулярной биологии опухолей, применение таких методов как лучевая терапия, химиотерапия, хирургические методы, общая выживаемость больных опухолевыми заболеваниями значительно не увеличилась за последние два десятилетия. Это связано с тем, что данные методы не позволяют полностью разрушать и удалять все опухолевые клетки, включая новые очаги метастазирования, локализованные в разных областях тела, в результате чего через некоторое время случается формирование вторичных опухолей. Поэтому на сегодняшний день существует необходимость в разработке новой технологии персонализированного лечения, направленного на разрушение опухолей на уровне одной клетки для увеличения выживаемости пациентов и снижения образования рецидивов.
Таким методом является применение комбинаторных наносистем на основе магнитных наночастиц с ДНК - аптамерами. Магнитные наночастицы на нанометровом масштабе демонстрируют новые оптические, магнитные, электронные и структурные свойства [1, 2], которые делают их перспективными инструментами в противораковой терапии [3]. Основной недостаток наночастиц заключается в том, что они накапливаются в здоровых тканях, вызывая токсичные побочные эффекты [4, 5].
Целенаправленная доставка требует функционализации наночастиц молекулярными зондами, такими как аптамеры, которые специфически связываются с уникальными биомолекулами раковых клеток [6, 7]. Аптамеры представляют собой короткие синтетические одноцепочечные ДНК или РНК, которые специфически связываются с различными мишенями с высокой аффинностью и селективностью [3, 4, 8]. По сравнению с антителами, аптамеры обладают низкой иммуногенностью, токсичность и стоимостью, поэтому активно применяются для терапевтических целей [3].
В этом исследовании мы демонстрируем метод магнитодинамической терапии основанный на применении покрытых золотом магнитных наночастиц (Au-МНЧ) модифицированных ДНК аптамерами для разрушения опухоли у мышей in vitroи in vivo.Для адресной доставки мы использовали AS-14 аптамеры специфичные к фибронектину (Фн) асцитной карциномы Эрлиха [9]. Фибронектин представляет собой большой гликопротеин, который служит важным компонентом внеклеточного матрикса, собирающегося в фибриллы, прикрепляя клетки к коллагеновым волокнам. Было показано, что помимо внеклеточного фибронектина клетки карциномы Эрлиха синтезируют и высвобождают большие количества Фн в культуральную среду in vitro,в асцитную жидкость и плазму in vivo[10]. AS- 14 аптамеры доставляют Au-МНЧ к опухоли карциномы Эрлиха и связывают частицы с молекулами фибронектина. Фн связывается с клеточной поверхностью через интегрины - большие трансмембранные адгезионные белки, которые обеспечивают физическую связь между внеклеточной матрицей и сократительным цитоскелетом [11]. Активация интегринов происходит за счет связывания лиганда и механической силы, вытягивающей в-субъединицу интегрина через фибронектин и возвращая ее в исходное положение. Недавно опубликованные экспериментальные данные и результаты молекулярного моделирования демонстрируют динамику активации интегрина за счет механической силы, вытягивающей интегрины до 6 нм в течение 6 нс [12]. Апоптоз, основанный на активации интегринов, может вызывать в дальнейшем активацию каспазы-8 [13 - 20].
Низкочастотное переменное магнитное поле (НПЭМП) вызывает колебания Au-МНЧ модифицированных аптамерами в комплексе с фибронектином. Таким образом, активность МНП управлялась НПЭМП. Преимущества предлагаемой технологии включают глубокое проникновение магнитного поля, высокую цитотоксическую активность в отношении раковых клеток и низкую токсичность для соседних нормальных клеток и тканей.
Цель работы - показать возможность противоопухолевого эффекта магнитодинамической терапии.
Задачи:
1. Разработать способ модификации покрытых золотом магнитных наночастиц ДНК-аптамерами;
2. Определить эффективность магнитодинамической терапии in vitroна клетках асцитной карциномы Эрлиха;
3. Определить эффективность магнитодинамической терапии in vivoна клетках асцитной карциномы Эрлиха.
Таким методом является применение комбинаторных наносистем на основе магнитных наночастиц с ДНК - аптамерами. Магнитные наночастицы на нанометровом масштабе демонстрируют новые оптические, магнитные, электронные и структурные свойства [1, 2], которые делают их перспективными инструментами в противораковой терапии [3]. Основной недостаток наночастиц заключается в том, что они накапливаются в здоровых тканях, вызывая токсичные побочные эффекты [4, 5].
Целенаправленная доставка требует функционализации наночастиц молекулярными зондами, такими как аптамеры, которые специфически связываются с уникальными биомолекулами раковых клеток [6, 7]. Аптамеры представляют собой короткие синтетические одноцепочечные ДНК или РНК, которые специфически связываются с различными мишенями с высокой аффинностью и селективностью [3, 4, 8]. По сравнению с антителами, аптамеры обладают низкой иммуногенностью, токсичность и стоимостью, поэтому активно применяются для терапевтических целей [3].
В этом исследовании мы демонстрируем метод магнитодинамической терапии основанный на применении покрытых золотом магнитных наночастиц (Au-МНЧ) модифицированных ДНК аптамерами для разрушения опухоли у мышей in vitroи in vivo.Для адресной доставки мы использовали AS-14 аптамеры специфичные к фибронектину (Фн) асцитной карциномы Эрлиха [9]. Фибронектин представляет собой большой гликопротеин, который служит важным компонентом внеклеточного матрикса, собирающегося в фибриллы, прикрепляя клетки к коллагеновым волокнам. Было показано, что помимо внеклеточного фибронектина клетки карциномы Эрлиха синтезируют и высвобождают большие количества Фн в культуральную среду in vitro,в асцитную жидкость и плазму in vivo[10]. AS- 14 аптамеры доставляют Au-МНЧ к опухоли карциномы Эрлиха и связывают частицы с молекулами фибронектина. Фн связывается с клеточной поверхностью через интегрины - большие трансмембранные адгезионные белки, которые обеспечивают физическую связь между внеклеточной матрицей и сократительным цитоскелетом [11]. Активация интегринов происходит за счет связывания лиганда и механической силы, вытягивающей в-субъединицу интегрина через фибронектин и возвращая ее в исходное положение. Недавно опубликованные экспериментальные данные и результаты молекулярного моделирования демонстрируют динамику активации интегрина за счет механической силы, вытягивающей интегрины до 6 нм в течение 6 нс [12]. Апоптоз, основанный на активации интегринов, может вызывать в дальнейшем активацию каспазы-8 [13 - 20].
Низкочастотное переменное магнитное поле (НПЭМП) вызывает колебания Au-МНЧ модифицированных аптамерами в комплексе с фибронектином. Таким образом, активность МНП управлялась НПЭМП. Преимущества предлагаемой технологии включают глубокое проникновение магнитного поля, высокую цитотоксическую активность в отношении раковых клеток и низкую токсичность для соседних нормальных клеток и тканей.
Цель работы - показать возможность противоопухолевого эффекта магнитодинамической терапии.
Задачи:
1. Разработать способ модификации покрытых золотом магнитных наночастиц ДНК-аптамерами;
2. Определить эффективность магнитодинамической терапии in vitroна клетках асцитной карциномы Эрлиха;
3. Определить эффективность магнитодинамической терапии in vivoна клетках асцитной карциномы Эрлиха.
Наше исследование демонстрирует эффективность целенаправленного магнитодинамического разрушения раковых клеток на примере асцитной карциномы Эрлиха с использованием Au-МНЧ in vitroи in vivoв низкочастотном переменном магнитном поле. Математическое моделирование показало, что синусоидальное магнитное поле 100 Э при частоте 50 Гц вызывает магнитодинамическое разрушение клеток с минимально возможными тепловыми эффектами на клетки и ткани. Для адресной доставки Au-МНЧ мы использовали аптамеры AS-14 специфичные к фибронектину асцитной карциномы Эрлиха, специфика которого заключается в посттрансляционных модификациях в 5 доменах фибронектина типа III (ФнШ5): треонин ацетилируется в положении 32 и фосфорилируется в положении 36. Описание этих модификаций в настоящее время отсутствует в Белковом банке данных http://www.rcsb.org/pdb/protein/P02751, что свидетельствует о их уникальности [9].
В данном исследовании аптамеры AS-14 доставляют Au-МНЧ в опухоль карциномы Эрлиха и связывают частицы с молекулами ФнШ5. Низкочастотное переменное магнитное поле вызывает колебания Au-МНЧ в комплексе с аптамерами, связанными с ФнШ5. Математическое моделирование магнитомеханического действия AS-M-Au-МНЧ на клетках показало, что низкочастотное переменное электромагнитное поле не вызывало локальную гипертермию. НПЭМП вращает наночастицу,
связанную с ФнШ5 по часовой стрелке, вытягивая в-субъединицу интегрина через фибронектин и возвращая ее в исходное положение
В данном исследовании аптамеры AS-14 доставляют Au-МНЧ в опухоль карциномы Эрлиха и связывают частицы с молекулами ФнШ5. Низкочастотное переменное магнитное поле вызывает колебания Au-МНЧ в комплексе с аптамерами, связанными с ФнШ5. Математическое моделирование магнитомеханического действия AS-M-Au-МНЧ на клетках показало, что низкочастотное переменное электромагнитное поле не вызывало локальную гипертермию. НПЭМП вращает наночастицу,
связанную с ФнШ5 по часовой стрелке, вытягивая в-субъединицу интегрина через фибронектин и возвращая ее в исходное положение