Введение 3
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
1.1 Биолюминесценция 5
1.2 Са2+-регулируемые фотопротеины 6
1.3 Са2+-регулируемый фотопротеин беровин 8
1.4 Роль С-концевых аминокислотных остатков в биолюминесценции
Са2+-регулируемых фотопротеинов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 14
2.1 Получение укороченных вариантов гена беровина 14
2.2 Очистка и активация фотопротеина беровина и его мутантов 14
2.3 Измерение биолюминесцентной активности 16
2.4 Измерение спектров биолюминесценции 16
2.5 Фото- и термо- инактивация 16
2.6 Реактивы 17
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 18
3.1 Создание экпрессионных конструкций укороченных вариантов беровина
3.2 Экспрессия и очистка белка 19
3.3. Биолюминесцентная активность укороченных мутантов беровина 21
3.4 Спектры биолюминесценции и флуоресценции 24
3.5 Фото- и термоинактивация 26
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 29
ВЫВОДЫ 30
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 31
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Биолюминесценцией называют явление свечения живых организмов, которое наблюдается у представителей различных таксонов: бактерий, грибов, одноклеточных водорослей, кишечнополостных, ракообразных, червей, моллюсков, насекомых и рыб [1]. Наибольшее распространение биолюминесценция получила у глубоководных морских организмов.
Наиболее распространенным субстратом для биолюминесцентных белков морских беспозвоночных является целентеразин [2]. Наиболее изученными белками, использующими целентеразин в качестве субстрата, являются Са2+- регулируемые фотопротеины, ответственные за свечение ряда морских кишечнополостных, таких, как медузы и гребневики. Са2+-регулируемые фотопротеины гидромедуз обладают высокой степенью гомологии аминокислотных последовательностей, в пределах 65-75%, а также пространственных структур [3]. Однако, фотопротеины гребневиков демонстрируют низкую степень гомологии с фотопротеинами гидромедуз. Так максимальная гомология аминокислотных последовательностей беровина из гребневика Beroe abyssicolaи обелина из гидроида Obelia longissimaсоставляет всего 29.4% [4].
Фотопротеины являются односубъединичными белками(~22 кДа), содержащими три Са2+ -связывающих центра «EF-hand» типа и представляют собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из апофотопротеина и молекулы органического субстрата - преактивированного кислородом целентеразина (2-гидропероксицелентеразина), который прочно, но нековалентно связан с белком. Связывание ионов кальция с фотопротеином, приводящее к изменению конформации белка, запускает реакцию декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина, в результате которой образуется целентерамид в возбужденном состоянии и СО2. Переход целентерамида из возбужденного состояния в основное сопровождается излучением кванта света [5].
Молекула фотопротеина имеет 2х-чашечную структуру, во внутренней, гидрофобной полости которой располагается молекула субстрата. У изученных на сегодняшний день фотопротеинов важное значение для изоляции полости и обеспечения правильной конформации белка имеет взаимодействие С-конца с N-концевой а-спиралью [6].
У большинства из известных к настоящему времени фотопротеинов С- концевой аминокислотой является пролин, тогда как у беровина на С-конце располагается тирозин. Возникает вопрос, оказывает ли влияние С-концевой тирозин на формирование активного фотопротеинового комплекса, и имеет ли значение длина С-концевого участка данного фотопротеина.
Цель
Исследовать роль С-концевых аминокислотных остатков в биолюминесценции Са2+-регулируемого фотопротеина беровина.
Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:
1. Синтезировать нуклеотидные последовательности, содержащие кодирующую часть укороченных вариантов гена фотопротеина беровина с делецией 2-х,3-х,4-х и 5 С-концевых аминокислотных остатков
2. Получить экспрессионные конструкции для синтеза укороченных вариантов беровина в E. coli.
3. Получить укороченные варианты беровина в высокоочищенном состоянии
4. Исследовать физико-химические и спектральные свойства укороченных вариантов беровина
5. Провести фотоинактивацию и термоинактивацию укороченных вариантов беровина
Представленная работа посвящена исследованию роли С-концевых аминокислотных остатков в биолюминесценции Са2+-регулируемого фотопротеина беровина.
В формировании активного фотопротеинового комплекса с субстратом - целентеразином у Са2+-регулируемых фотопротеинов кишечнополостных играет важную роль С-концевой участок. У большиства из известных фотопротенов С-концевой аминокислотой является пролин. Удаление пролина приводит к нарушению формирования фотопротеинового комплекса. Как показали наши исследования, не смотря на отсутствие на С-конце беровина пролина, делеция С-концевых аминокислотных остатков также приводит к сильному снижению биолюминесцентной активности.
В нашем исследовании мы выяснили, что делеция любого количества С- концевых аминокислотных остатков в беровине приводит к нарушению формирования фотопротеинового комплекса, уменьшению выхода активного белка и значительному снижению биолюминесцентной активности, что свидетельствует об их непосредственном участии в этих процессах. Мы не увидели никакой зависимости биолюминесценции беровина от того, какой аминокислотный остаток является С-концевым после делеции. Однако относительно спектров флуоресценции Са2+-разряженных белков такая зависимость прослеживается: флуоресценция укороченных вариантов с остатком Tyr на C-конце, в отличие от вариантов с С-концевым Ala или Val, имеет вклад в длинноволновой области спектра, что свидетельствует о более полярном окружении целентерамида в данном случае.
Таким образом, результаты, описанные в данной работе, вносят вклад в понимание роли С-концевых аминокислотных остатков в биолюминесценции Са2+-регулируемого фотопротеина беровина. Перспективы дальнейших исследований будут связаны, прежде всего, с детальным установлением механизма образования активного фотопротеинового комплекса, с участием С- концевых аминокислотных остатков беровина. Полученные результаты имеют в первую очередь фудаментальное значение, но в дальнейшим могут иметь и практическую важность, поскольку использование белка в аналитических целях предполагает возможность его модификации, в том числе и в области С- концевого участка.
