Иммобилизация ферментов на модифицированные наноалмазы детонационного синтеза
|
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 8
1.1 Физико-химические свойства наноалмазов 8
1.1.1 Наноалмазы детонационного синтеза 8
1.1.2 Особенности наноалмазов детонационного синтеза 10
1.2 Модифицированные наноалмазы (МНА) 12
1.2.1 Свойства модифицированных наноалмазов детонационного синтеза 13
1.3 Иммобилизация ферментов 14
1.3.1 Преимущества иммобилизированных ферментов 15
1.3.2 Виды иммобилизации ферментов 16
1.4 Лизоцим. Основные свойства 20
1.5 Гиалуронидаза. Основные свойства 24
1.6 Photobacterium phosphoreum 28
2 Материалы и методы исследования 30
2.1 Используемые ферменты 30
2.1.1 Лизоцим ( Lysozyme) 30
2.1.2 Гиалуронидаза (Hyaluronidase) 31
2.2 Используемые модифицированные наноалмазы 32
2.3 Используемые бактерии 32
2.4 Спектрофотометрия 32
2.5 Получение культуры клеток для эксперимента 33
2.6 Активация МНА 34
2.7 Ковалентная иммобилизация фермента на частицы МНА 34
2.8 Проверка работоспособности комплекса 35
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 37
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 38
1 Обзор литературы 8
1.1 Физико-химические свойства наноалмазов 8
1.1.1 Наноалмазы детонационного синтеза 8
1.1.2 Особенности наноалмазов детонационного синтеза 10
1.2 Модифицированные наноалмазы (МНА) 12
1.2.1 Свойства модифицированных наноалмазов детонационного синтеза 13
1.3 Иммобилизация ферментов 14
1.3.1 Преимущества иммобилизированных ферментов 15
1.3.2 Виды иммобилизации ферментов 16
1.4 Лизоцим. Основные свойства 20
1.5 Гиалуронидаза. Основные свойства 24
1.6 Photobacterium phosphoreum 28
2 Материалы и методы исследования 30
2.1 Используемые ферменты 30
2.1.1 Лизоцим ( Lysozyme) 30
2.1.2 Гиалуронидаза (Hyaluronidase) 31
2.2 Используемые модифицированные наноалмазы 32
2.3 Используемые бактерии 32
2.4 Спектрофотометрия 32
2.5 Получение культуры клеток для эксперимента 33
2.6 Активация МНА 34
2.7 Ковалентная иммобилизация фермента на частицы МНА 34
2.8 Проверка работоспособности комплекса 35
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 37
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 38
В 1959 году Нобелевский лауреат по физике Ричард Фейнман в своей лекции «Внизу полным-полно места» (Feynman, R.P. 1961. Thereisplentyofroomatthebottom. In Miniaturization. NewYork: Reinhold) рассказывал о перспективах, которые сулит изготовление материалов и устройств на атомном и молекулярном уровне [1]. Однако, только после появления необходимого оборудования в 1980-х годах, стало возможным изучение и создания подобных структур. Одновременно с этим были усовершенствованы вычислительные техники, которые позволили прогнозировать характеристики материалов, имеющих наноразмеры. Все это стимулировало научное общество к изучению свойств и создание новых наноматериалов [1].
В связи с накоплением за последние десятилетия обширного объема информации о наноматериалых научным обществом было принято понятие «нанонаука». Нанонаука занимается исследованием свойств вещества в нанометровом масштабе, т.е., изучением объектов, размер которых лежит в интервале от 1-100 нм [2,3]. Помимо изучения свойств существующих нанообъектов ученые занимаются созданием новых наноразмерных материалов и систем на основе наноразмерных объектов. Процесс конструирования приборов и систем, свойства которых определяются их формой и размером на нанометровом уровне, получил называние нанотехнологии.
Нанотехнологии в настоящее время бурно развиваются, так как они позволяют открывать новые возможности для решения широкого спектра задач, возникающих в различных сферах деятельности человека. Новые наноматериалы и нанотехнологии стремительно вводятся в биологию, биотехнологию, медицину.
В 1992 году была основан первый Международный комитет по наноструктурированнымнаноматериалам (International Committee on Nanostructured Materials). Под эгидой этого комитета каждые два года проводится Международная конференция по наноструктурированным материалам. Цель конференции заключается в обсуждении последних открытий в области нанотехнологий, глобальных тенденций, обмене новыми идеями, концепциями, методиками и перспективами. В 2014 году конференция проходила в России (NANO 2014) на базе Московского государственного университета (МГУ). Конференция NANO 2016 будет проходит в августе в Канаде.
В России в 2008 году была создана Общероссийская общественная организация «Нанотехнологическое общество России» (НОР). Главной целью НОР, по данным с официального сайта, является «развитие творческой активности своих членов, удовлетворение их научных, профессиональных интересов и информационного обеспечения, а также эффективное использование кооперации интеллектуальных и производственных сил, граждан и организаций для развития наноиндустрии в России, содействие в реализации научных разработок в коммерчески эффективных промышленных проектах». По данным на 2011 год в состав НОР входит 19 членов из Красноярского края [6]. В мире же каждый год проводится большое количество конференций, семинаров, посвященных наноматериалам, нанотехнологиям и с каждым годом интерес становится все больше. Одним из таких наноматериалов являются наноалмазы.
Наибольший интерес для специалистов, работающих в этой области, представляют модифицированные наноалмазы (МНА) детонационного синтеза, образующие в водной среде устойчивые дисперсные системы и легко адаптируемые для медико-биологических исследований. Производство наноалмазов детонационного синтеза осуществляется в ряде зарубежных стран (например, в Китае, Украине, Болгарии), но первенство в разработке этого метода принадлежит российским и американским ученым.
На протяжении многих лет наноалмазы применяли только для решения технических задач. Однако, физико-химические свойства этих наночастиц позволяют говорить о перспективности их применения в биотехнологии в качестве нового адсорбента для разработки эффективных методов сепарации и очистки биополимеров и конструирования систем индикации и адресной доставки веществ [8]. Но до недавнего времени проведение экспериментов с наноалмазами детонационного синтеза было затруднено, так как они обладают малой коллоидной устойчивостью в гидрозолях и быстро образуют осадок. Это не позволяло получить гидрозоли с точной концентрацией частиц, осуществлять их стерилизацию, хранить в замороженном состоянии и применять в длительных медико-биологических экспериментах .
В настоящее время в ИБФ СО РАН разработаны технологии получения модифицированных наноалмазов, обладающих высокой коллоидной устойчивостью в дисперсионных средах, адаптированных для медико-биологических исследований . Получение модифицированных наноалмазов, обладающих повышенной коллоидной стабильностью и не требующих применения каких-либо стабилизирующих добавок для получения устойчивых гидрозолей , открыло возможность проведения длительных экспериментов медико-биологического характера на лабораторных животных.
В ходе исследований, проводимых в институте биофизики СО РАН, было показано, что МНА могут применяться как полифункциональный адсорбент для экспресс-выделения и очистки целевых белков из рекомбинантных источников и природных объектов и дополнительной очистки белковых препаратов, поставляемых коммерческими фирмами .
Ранее было установлено, что ферменты, адсорбированные на наноалмазах, сохраняют свою каталитическую функцию, что позволяет создавать на основе наноалмазов и ферментов комплексы, которые могут найти применение в таких областях, как медицина и биология
В связи с накоплением за последние десятилетия обширного объема информации о наноматериалых научным обществом было принято понятие «нанонаука». Нанонаука занимается исследованием свойств вещества в нанометровом масштабе, т.е., изучением объектов, размер которых лежит в интервале от 1-100 нм [2,3]. Помимо изучения свойств существующих нанообъектов ученые занимаются созданием новых наноразмерных материалов и систем на основе наноразмерных объектов. Процесс конструирования приборов и систем, свойства которых определяются их формой и размером на нанометровом уровне, получил называние нанотехнологии.
Нанотехнологии в настоящее время бурно развиваются, так как они позволяют открывать новые возможности для решения широкого спектра задач, возникающих в различных сферах деятельности человека. Новые наноматериалы и нанотехнологии стремительно вводятся в биологию, биотехнологию, медицину.
В 1992 году была основан первый Международный комитет по наноструктурированнымнаноматериалам (International Committee on Nanostructured Materials). Под эгидой этого комитета каждые два года проводится Международная конференция по наноструктурированным материалам. Цель конференции заключается в обсуждении последних открытий в области нанотехнологий, глобальных тенденций, обмене новыми идеями, концепциями, методиками и перспективами. В 2014 году конференция проходила в России (NANO 2014) на базе Московского государственного университета (МГУ). Конференция NANO 2016 будет проходит в августе в Канаде.
В России в 2008 году была создана Общероссийская общественная организация «Нанотехнологическое общество России» (НОР). Главной целью НОР, по данным с официального сайта, является «развитие творческой активности своих членов, удовлетворение их научных, профессиональных интересов и информационного обеспечения, а также эффективное использование кооперации интеллектуальных и производственных сил, граждан и организаций для развития наноиндустрии в России, содействие в реализации научных разработок в коммерчески эффективных промышленных проектах». По данным на 2011 год в состав НОР входит 19 членов из Красноярского края [6]. В мире же каждый год проводится большое количество конференций, семинаров, посвященных наноматериалам, нанотехнологиям и с каждым годом интерес становится все больше. Одним из таких наноматериалов являются наноалмазы.
Наибольший интерес для специалистов, работающих в этой области, представляют модифицированные наноалмазы (МНА) детонационного синтеза, образующие в водной среде устойчивые дисперсные системы и легко адаптируемые для медико-биологических исследований. Производство наноалмазов детонационного синтеза осуществляется в ряде зарубежных стран (например, в Китае, Украине, Болгарии), но первенство в разработке этого метода принадлежит российским и американским ученым.
На протяжении многих лет наноалмазы применяли только для решения технических задач. Однако, физико-химические свойства этих наночастиц позволяют говорить о перспективности их применения в биотехнологии в качестве нового адсорбента для разработки эффективных методов сепарации и очистки биополимеров и конструирования систем индикации и адресной доставки веществ [8]. Но до недавнего времени проведение экспериментов с наноалмазами детонационного синтеза было затруднено, так как они обладают малой коллоидной устойчивостью в гидрозолях и быстро образуют осадок. Это не позволяло получить гидрозоли с точной концентрацией частиц, осуществлять их стерилизацию, хранить в замороженном состоянии и применять в длительных медико-биологических экспериментах .
В настоящее время в ИБФ СО РАН разработаны технологии получения модифицированных наноалмазов, обладающих высокой коллоидной устойчивостью в дисперсионных средах, адаптированных для медико-биологических исследований . Получение модифицированных наноалмазов, обладающих повышенной коллоидной стабильностью и не требующих применения каких-либо стабилизирующих добавок для получения устойчивых гидрозолей , открыло возможность проведения длительных экспериментов медико-биологического характера на лабораторных животных.
В ходе исследований, проводимых в институте биофизики СО РАН, было показано, что МНА могут применяться как полифункциональный адсорбент для экспресс-выделения и очистки целевых белков из рекомбинантных источников и природных объектов и дополнительной очистки белковых препаратов, поставляемых коммерческими фирмами .
Ранее было установлено, что ферменты, адсорбированные на наноалмазах, сохраняют свою каталитическую функцию, что позволяет создавать на основе наноалмазов и ферментов комплексы, которые могут найти применение в таких областях, как медицина и биология
Данная работа была посвящена изучению возможности создания на основе наноалмазов детонационного синтеза комплексов лизоцима и гиалуронидазы для медицинского и биологического применения. В результате проведенных исследований получены следующие результаты:
- получены комплексы МНА/лизоцим и МНА/гиалуронидаза;
-показана работоспособность комплекса МНА/лизоцим на бактериях Photobacterium phosphoreum(ш.2015);
-определено оптимальное весовое соотношение фермент/МНА для максимальной пришивки лизоцима и гиалуронидазы;
- определена концентрация лизоцима, при которой наблюдается его наибольшая активность в отношении бактерий Photobacterium phosphoreum;
- отработано применение ЭДТА для усиления эффекта комплекса МНА/лизоцим;
Полученные данные показывают, что может быть получен рабочий комплекс лизоцим/фермент, который может найти свое применение в медицине. Однако, для того, чтобы говорить о возможности применения комплекса МНА/гиалуронидаза в медицине, нужно провести дополнительные исследования.
- получены комплексы МНА/лизоцим и МНА/гиалуронидаза;
-показана работоспособность комплекса МНА/лизоцим на бактериях Photobacterium phosphoreum(ш.2015);
-определено оптимальное весовое соотношение фермент/МНА для максимальной пришивки лизоцима и гиалуронидазы;
- определена концентрация лизоцима, при которой наблюдается его наибольшая активность в отношении бактерий Photobacterium phosphoreum;
- отработано применение ЭДТА для усиления эффекта комплекса МНА/лизоцим;
Полученные данные показывают, что может быть получен рабочий комплекс лизоцим/фермент, который может найти свое применение в медицине. Однако, для того, чтобы говорить о возможности применения комплекса МНА/гиалуронидаза в медицине, нужно провести дополнительные исследования.