ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 5
1.1. Тканевая инженерия 5
1.2. Скаффолд-технология в тканевой инженерии 6
1.3. Полигидроксиалканоаты 8
1.3.1. Определение полигидроксиалканоатов 8
1.3.2. Виды полигидроксиалканоатов 8
1.3.3. Микроорганизмы 10
1.3.4. Механические и температурные свойства полигидроксиалканоатов . 10
1.3.5. Биосовместимость полигидроксиалканоатов 11
1.3.6. Наиболее изученные виды полигидроксиалканоатов 13
1.3.7. Применение полигидроксиалканоатов в тканевой инженерии 13
1.4. Механизм заживления ран 14
1.5. Необходимость дермальных эквивалентов 15
1.5. Коммерческие препараты 17
1.6. Композиты 19
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23
2.1. Материалы 23
2.2. Характеристика используемых образцов поли-3-гидроксибутирата и получение ультратонкого нетканого волокна 23
2.3. Выделение коллагена I типа из сухожилий хвостов крыс 23
2.4. Приготовление коллагенового геля 23
2.5. Получение и культивирование культуры мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга крысы 24
2.6. Оценка цитотоксичности полимерного матрикса in vitroи сравнение интенсивности роста на матриксах у ММСК костного мозга крысы и фибробластов дермы крысы 24
2.7. Проведение операций на опытных белых крысах 25
2.8. Планиметрия 26
2.9. Гистологический анализ 26
2.10. Статистическая обработка полученных результатов 28
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 29
3.1. Оценка биосовместимости полученного клеточного матрикса in vitro. .. 29
ВЫВОДЫ 30
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 31
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 32
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 33
Заместительная клеточная терапия - перспективное направление регенеративной медицины, в котором в настоящее время широко применяют культивируемые клетки для восстановления и лечения поврежденных органов и тканей, в том числе и кожных покровов. В мировой практике для замещения дефектов кожи созданы ее аналоги - так называемые дермальные эквиваленты (ДЭ) с использованием фибробластов и кератиноцитов человека для лечения ожоговых и трофических ран. К настоящему времени разработаны различные виды ДЭ, но главным и общим принципом для всех них является аналогия со структурой нормальной кожи: эквивалент состоит из двух слоев - дермального и эпидермального. В основе дермального слоя лежит трехмерный матрикс - чаще всего коллаген или фибрин, несущий фибробласты, а эпидермальный слой формируется на поверхности дермального за счет роста и пролиферации культивируемых кератиноцитов.
Сегодня среди биоматериалов, применяемых в медицине и активно изучаемых для конструктирования матриксов функционирующих клеток, выделяют альгинаты, коллаген, алифатические полиэфиры, полиамиды, сегментированные полиэфируретаны, силикон, полиэтилентерефталат, полимеры гликолевой и молочной кислот, а также новый класс природных полимеров, синтезируемых микроорганизмами, - полигидроксиалканоаты. Однако, несмотря на все многообразие используемых компонентов, еще не найдено уникального ДЭ, который полностью отвечал бы всем необходимым требованиям и мог использоваться повсеместно для лечения дефектов кожи.
Целью настоящей работы является конструирование тканеинженерного раневого покрытия на основе ультратонкого нетканого волокна из полигидроксиалканоатов, коллагенового геля из коллагена I типа и культуры мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК), выделенных из стромы костного мозга крысы.
Задачи:
1. Выделение коллагена I типа из сухожилий хвостов крыс и создание на его основе коллагенового геля для внесения в состав раневого покрытия.
2. Выделение ММСК костного мозга крыс линии «Вистар» и их последующее культивирование для внесения в состав раневого покрытия.
3. Оценка биосовместимости полимерного матрикса in vitro, определение цитотоксичности матрикса.
4. Конструирование трехмерного раневого покрытия на основе нетканого волокна из полигидроксиалканоатов, коллагенового геля и ММСК костного мозга крысы.
5. Оценка эффективности сконструированных тканеинженерных раневых покрытий на заживление модельных дефектов кожи у белых крыс линии «Вистар».
В ходе проведенной работы были изучены и отработаны методы выделения и культивирования клеток разных типов, методы получения коллагена I типа из сухожилий хвостов крыс, методы получения коллагенового геля, методы проведения МТТ-теста, методы окрашивания флуоресцентными красителями, методы планиметрии и гистологического анализа. Кроме того, была исследована цитотоксичность полимерного нетканого волокна и коллагенового геля в культуре ММСК костного мозга крысы и культуре фибробластов дермы крысы. Было получено раневое покрытие, представляющее собой трехмерный матрикс, состоящий из нетканого волокна и нанесенного на его поверхность коллагенового геля, и ММСК костного мозга крысы, и была показана эффективность его использования. Для выявления эффективности сконструированного раневого покрытия был проведен эксперимент по восстановлению модельных кожных дефектов у белых крыс линии «Вистар». В конце работы были сделаны все необходимые выводы.
