Помощь студентам в учебе
БИОАКТИВНЫЕ КОМПОЗИЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИ (s-КАПРОЛАКТОНА) И ГИДРОКСИАПАТИТА ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНЫХ ТКАНЕЙ: ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА
|
ВВЕДЕНИЕ 6
Глава 1. Современные композиционные биорезорбируемые материалы для
инженерии костной ткани 16
1.1 Строение костных тканей и принципы разработки материалов для их
регенерации 16
1.1.1 Особенности строения и структурообразования костных тканей 16
1.1.2 Основные требования к материалам для остеосинтеза и инженерии
костной ткани 18
1.2 Материалы для регенерации крупных дефектов костных тканей 19
1.2.1 Биорезорбируемые алифатические полиэфиры 23
1.2.2 Биоактивные композиционные материалы для регенерации костных
тканей 25
1.2.2.1 Остеоиндуктивные фосфаты кальция 25
1.2.2.2 Композиционные материалы на основе биоразлагаемых полиэфиров и
фосфатов кальция 27
1.2.2.3 Изготовление персонализированных имплантатов для замещения
крупных костных дефектов 28
1.3 Модифицирование поверхности скаффолдов для регенерации костных тканей 34
1.3.1 Изменение морфологии поверхности 34
1.3.2 Иммобилизация биологически активных макромолекул 35
1.3.3 Химическое модифицирование и введение функциональных групп 36
1.3.4 Кальций-фосфатные покрытия 37
1.4 Постановка цели и задач диссертационного исследования 38
Глава 2. Материалы, методы и методология исследования 40
2.1 Материалы исследования 40
2.2 Способ получения композиционных материалов 41
2.3 Изготовление филаментов для 3D печати 42
2.4 3D печать скаффолдов 42
2.5 Способ обработки в смеси «растворитель/нерастворитель» 43
2.6 Методы исследований физико-химических свойств композиционных
материалов и скаффолдов 44
2.6.1 Сканирующая электронная микроскопия 44
2.6.2 Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия 45
2.6.3 Термогравиметрический анализ 45
2.6.4 Дифференциальная сканирующая калориметрия 45
2.6.5 Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье 45
2.6.6 Рентгенофазовый анализ 46
2.6.7 Гель-проникающая хроматография 46
2.6.8 Одноосное сжатие 47
2.6.9 Эффект памяти формы 47
2.7 Методы исследования биологических свойств композиционных
скаффолдов 48
2.7.1 Оценка жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток на
поверхности скаффолдов 48
2.7.2 Оценка остеогенной дифференцировки остеобластов при
культивировании со скаффолдами 49
2.7.3 Остеоинтеграция скаффолдов при имплантации в область костного
дефекта с использованием лабораторных животных 50
2.7.3.1 Замещение дефекта носовой кости 50
2.7.3.2 Морфологическая оценка тканей в области
имплантации 52
2.7.3.3 Замещение радиального дефекта большеберцовой
кости 52
2.8 Статистическая обработка результатов 55
Глава 3. Влияние способа получения и состава на физико-химические и структурно-фазовые свойства композиционных материалов 56
3.1. Морфология и элементный состав 57
3.2. Термические свойства 58
3.3. Структурно-фазовое строение 61
Глава 4. Влияние состава композиционных материалов на параметры формирования биомиметических скаффолдов, их физико-химические и
функциональные свойства 66
4.1. Режим 3D печати 67
4.2. Морфология скаффолдов 69
4.3. Механические свойства скаффолдов 71
4.4. Эффект памяти формы 72
4.5. Молекулярно-массовые характеристики полимерной матрицы 74
4.6. Биосовместимость скаффолдов in vitro 78
4.7. Биосовместимость и биоактивность скаффолдов in vivo 80
Глава 5. Влияние поверхностного модифицирования композиционных биомиметических скаффолдов смесью «растворитель/не растворитель» на их
функциональные свойства 84
5.1. Морфология модифицированных скаффолдов 84
5.2. Физико-химические характеристики поверхности модифицированных
скаффолдов 86
5.3. Биосовместимость и биоактивность модифицированных скаффолдов in
vitro 88
5.4. Биосовместимость и биоактивность модифицированных скаффолдов in
vivo 89
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 94
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 97
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 98
ПРИЛОЖЕНИЕ А Акты об использовании результатов диссертационной работы в исследованиях и экспериментальной клинической практике 116
ПРИЛОЖЕНИЕ Б Акт внедрения в научную деятельность 120
ПРИЛОЖЕНИЕ В Акт о внедрении в инновационную деятельность 121
ПРИЛОЖЕНИЕ Г Патент № 2775108 РФ от 28.06.22 122
ПРИЛОЖЕНИЕ Д Патент № 780930 РФ от 04.10.22 123
ПРИЛОЖЕНИЕ Е Патент № 2813693 РФ от 15.02.24 124
ПРИЛОЖЕНИЕ Ж Патент № 2815644 РФ от 19.03.24 125
ПРИЛОЖЕНИЕ З Патент № 2820632 РФ от 06.06.24 126
Глава 1. Современные композиционные биорезорбируемые материалы для
инженерии костной ткани 16
1.1 Строение костных тканей и принципы разработки материалов для их
регенерации 16
1.1.1 Особенности строения и структурообразования костных тканей 16
1.1.2 Основные требования к материалам для остеосинтеза и инженерии
костной ткани 18
1.2 Материалы для регенерации крупных дефектов костных тканей 19
1.2.1 Биорезорбируемые алифатические полиэфиры 23
1.2.2 Биоактивные композиционные материалы для регенерации костных
тканей 25
1.2.2.1 Остеоиндуктивные фосфаты кальция 25
1.2.2.2 Композиционные материалы на основе биоразлагаемых полиэфиров и
фосфатов кальция 27
1.2.2.3 Изготовление персонализированных имплантатов для замещения
крупных костных дефектов 28
1.3 Модифицирование поверхности скаффолдов для регенерации костных тканей 34
1.3.1 Изменение морфологии поверхности 34
1.3.2 Иммобилизация биологически активных макромолекул 35
1.3.3 Химическое модифицирование и введение функциональных групп 36
1.3.4 Кальций-фосфатные покрытия 37
1.4 Постановка цели и задач диссертационного исследования 38
Глава 2. Материалы, методы и методология исследования 40
2.1 Материалы исследования 40
2.2 Способ получения композиционных материалов 41
2.3 Изготовление филаментов для 3D печати 42
2.4 3D печать скаффолдов 42
2.5 Способ обработки в смеси «растворитель/нерастворитель» 43
2.6 Методы исследований физико-химических свойств композиционных
материалов и скаффолдов 44
2.6.1 Сканирующая электронная микроскопия 44
2.6.2 Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия 45
2.6.3 Термогравиметрический анализ 45
2.6.4 Дифференциальная сканирующая калориметрия 45
2.6.5 Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье 45
2.6.6 Рентгенофазовый анализ 46
2.6.7 Гель-проникающая хроматография 46
2.6.8 Одноосное сжатие 47
2.6.9 Эффект памяти формы 47
2.7 Методы исследования биологических свойств композиционных
скаффолдов 48
2.7.1 Оценка жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток на
поверхности скаффолдов 48
2.7.2 Оценка остеогенной дифференцировки остеобластов при
культивировании со скаффолдами 49
2.7.3 Остеоинтеграция скаффолдов при имплантации в область костного
дефекта с использованием лабораторных животных 50
2.7.3.1 Замещение дефекта носовой кости 50
2.7.3.2 Морфологическая оценка тканей в области
имплантации 52
2.7.3.3 Замещение радиального дефекта большеберцовой
кости 52
2.8 Статистическая обработка результатов 55
Глава 3. Влияние способа получения и состава на физико-химические и структурно-фазовые свойства композиционных материалов 56
3.1. Морфология и элементный состав 57
3.2. Термические свойства 58
3.3. Структурно-фазовое строение 61
Глава 4. Влияние состава композиционных материалов на параметры формирования биомиметических скаффолдов, их физико-химические и
функциональные свойства 66
4.1. Режим 3D печати 67
4.2. Морфология скаффолдов 69
4.3. Механические свойства скаффолдов 71
4.4. Эффект памяти формы 72
4.5. Молекулярно-массовые характеристики полимерной матрицы 74
4.6. Биосовместимость скаффолдов in vitro 78
4.7. Биосовместимость и биоактивность скаффолдов in vivo 80
Глава 5. Влияние поверхностного модифицирования композиционных биомиметических скаффолдов смесью «растворитель/не растворитель» на их
функциональные свойства 84
5.1. Морфология модифицированных скаффолдов 84
5.2. Физико-химические характеристики поверхности модифицированных
скаффолдов 86
5.3. Биосовместимость и биоактивность модифицированных скаффолдов in
vitro 88
5.4. Биосовместимость и биоактивность модифицированных скаффолдов in
vivo 89
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 94
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 97
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 98
ПРИЛОЖЕНИЕ А Акты об использовании результатов диссертационной работы в исследованиях и экспериментальной клинической практике 116
ПРИЛОЖЕНИЕ Б Акт внедрения в научную деятельность 120
ПРИЛОЖЕНИЕ В Акт о внедрении в инновационную деятельность 121
ПРИЛОЖЕНИЕ Г Патент № 2775108 РФ от 28.06.22 122
ПРИЛОЖЕНИЕ Д Патент № 780930 РФ от 04.10.22 123
ПРИЛОЖЕНИЕ Е Патент № 2813693 РФ от 15.02.24 124
ПРИЛОЖЕНИЕ Ж Патент № 2815644 РФ от 19.03.24 125
ПРИЛОЖЕНИЕ З Патент № 2820632 РФ от 06.06.24 126
Актуальность темы исследования. В условиях общего снижения уровня инвалидизации населения в последние десятилетия заболевания опорнодвигательной системы продолжают оставаться значимой медицинской и социальной проблемой. Несмотря на успехи современной травматологии в профилактике и лечении заболеваний, травматизм, общее старение населения и врождённые патологии приводят к сохранению высокого уровня распространенности заболеваний костно-мышечной системы. Одной из наиболее сложных задач в современной ортопедии и травматологии является хирургическое лечение крупных дефектов костей, в частности, радиальных повреждений. В связи с этим, поиск новых методов и материалов для повышения эффективности консолидации костных тканей и сокращения сроков лечения является крайне актуальным направлением исследований. Перспективным подходом в этой области является применение методов тканевой инженерии, заключающихся в использовании функциональных материалов, стимулирующих рост живых тканей. Как правило, такие материалы должны быть биорезорбируемыми и обладать биоактивными свойствами. На сегодняшний день в качестве материалов для создания биорезорбируемых имплантатов в травматологии и ортопедии широко исследуются линейные алифатические полиэфиры, в числе которых полимолочная кислота (ПМК), поли (е-капролактон) (ПКЛ) и полигликолиевая кислота (ПГК), а также их сополимеры. Однако их основным недостатком является отсутствие биоактивных свойств, что ограничивает их эффективность при регенерации костных тканей. В связи с этим актуальной задачей медицинского материаловедения становится разработка биорезорбируемых композиционных материалов, состоящих из алифатических полиэфиров и биологически активных наполнителей, таких как фосфаты кальция различной химической и кристаллической структуры. Разработка таких материалов позволит существенно повысить эффективность лечения и сократить сроки остеосинтеза в клинической практике.
Степень разработанности темы исследования. Разработка и исследование композиционных материалов на основе биоразлагаемых полиэфиров для инженерии костных тканей выполняются в ряде ведущих исследовательских групп в России и за рубежом. Известны работы научных групп Университета науки и технологий МИСИС (Ф.С. Сенатов, Россия), НИЦ Курчатовского центра (С.Н. Чвалун, Россия), университета Саленте (C. Esposito Corcione, Италия), Квинслендского университета (D. Hutmacher, Австралия), университета Гренобль- Альпы (C. Picart, Франция). В Лаборатории плазменных гибридных систем НОЦ им. Б.П. Вейнберга Национального исследовательского Томского политехнического университета под руководством С.И. Твердохлебов более 10 лет ведутся разработки по созданию и функционализации полимерных, металлических и керамических материалов для создания имплантируемых изделий медицинского назначения.
Исследования показывают, что фосфаты кальция обладают высокой эффективностью в качестве наполнителей полимерных имплантатов для регенерации костных тканей. Добавление фосфатов кальция в полимерную матрицу обеспечивает биосовместимость имплантатов и способствует их лучшей остеоинтеграции. Эти характеристики делают композиционные материалы на основе алифатических полиэфиров и фосфатов кальция перспективными для использования в ортопедии и травматологии. Однако влияние высоких степеней наполнения биоактивными компонентами на физико-химические, биологические и технологические свойства таких материалов остаётся недостаточно изученным. Композиционные материалы с высоким содержанием наполнителя, превышающим 20 масс.%, способны более точно имитировать химический и фазовый состав костной ткани. Это, в свою очередь, может способствовать ускорению остеоинтеграции имплантатов и сокращению сроков остеосинтеза. Изучение и оптимизация таких высоконаполненных композиций является актуальной задачей.
Исходя из проведённого анализа, была сформулирована цель работы - разработка высоконаполненных биоактивных композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита для использования в качестве материала 3D печати биомиметических скаффолдов для регенерации костных тканей.
Для достижения поставленной цели сформулированы и решены следующие задачи:
1. Разработать способ получения композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита с наполнением до 40 масс.%.
2. Разработать режимы изготовления композиционных филаментов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита с наполнением до 40 масс.%.
3. Определить оптимальные условия FDM 3D печати биомиметических скаффолдов из композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита с наполнением до 40 масс.%.
4. Исследовать влияние способа получения и массовой доли гидроксиапатита на физико-химические и структурно-фазовые свойства композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита с наполнением до 40 масс.%.
5. Исследовать влияние массовой доли гидроксиапатита на физикохимические и биологические свойства биомиметических скаффолдов, изготовленных методом FDM 3D печати из композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита с наполнением до 40 масс.%.
6. Разработать способ функционализации поверхности биомиметических скаффолдов, изготовленных из композиционных материалов на основе поли (е- капролактона) и гидроксиапатита, для стимулирования остеогенной дифференцировки остеобластов на их поверхности.
Научная новизна:
1. Впервые предложен способ изготовления высоконаполненных композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита путём смешивания в низкоскоростной шаровой мельнице раствора поли (е- капролактона) в ацетоне с порошком гидроксиапатита. Предложенный способ позволяет получить композиционные материалы с наполнением гидроксиапатитом до 40 масс.%, эффективностью наполнения от 84 до 94% и гомогенным распределением наполнителя в полимерной матрице. Полученные композиционные материалы обладают высокой термической и химической стабильностью.
2. Для полученных композиционных материалов с наполнением гидроксиапатитом до 40 масс.% определены оптимальные режимы FDM 3D печати скаффолдов с биомиметической структурой в форме гироида. Установлены зависимости между массовой долей гидроксиапатита в материале и технологическими, физико-химическими и биологическими свойствами скаффолдов.
3. Впервые предложен способ закрепления частиц гидроксиапатита на поверхности скаффолдов путём обработки в смеси «растворитель/не растворитель». Установлено, что обработка биомиметических скаффолдов из композиционных материалов суспензией гидроксиапатита в смеси толуола и этанола позволяет закрепить на их поверхности частицы гидроксиапатита. Частицы гидроксиапатита индуцируют остеогенную дифференцировку остеобластов на поверхности скаффолдов и обеспечивают остеоинтеграцию скаффолдов при имплантации в область радиального дефекта трубчатой кости.
Теоретическая значимость заключается в получении новых научных результатов, имеющих фундаментальное значение в областях медицинского материаловедения и разработки медицинских изделий для регенерации костных тканей. В работе установлены ключевые положения, касающиеся получения биорезорбируемых композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита, обладающих биоактивными свойствами. Выявлены закономерности влияния состава композиционных материалов на технологические параметры 3D печати биомиметических скаффолдов по технологии FDM, их физико-химические и механические свойства, а также биосовместимость. Установлены новые взаимосвязи между массовой долей наполнителя, химическим составом, термическими и механическими свойствами, структурно-фазовым строением полученных композиционных материалов и изготовленных из них методом FDM 3D печати биомиметических скаффолдов. Установленные закономерности способствуют развитию фундаментальных и прикладных знаний о биорезорбируемых композиционных материалах для регенерации костных тканей.
Практическая значимость состоит в том, что выявленные закономерности влияния состава и способа получения композиционных материалов на их физикохимические, биологические и технологические свойства могут быть использованы для создания новых биорезорбируемых медицинских изделий, предназначенных для регенерации костных тканей. Результаты исследования были внедрены в научную деятельность и экспериментальную клиническую практику в ФГБУ «НМИЦ ТО имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава России (Акты об использовании результатов диссертационной работы в исследованиях и экспериментальной клинической практике утверждены заместителем директора по научной работе, к.б.н., Е.Н. Овчинниковым) (Приложение А), в научную деятельность ФГБОУ ВО СЗГМУ имени И.И. Мечникова Минздрава России (Акт внедрения в научную деятельность утверждён д.м.н., профессором, проректором по науке и инновационной деятельности Н.В. Бакулиной) (Приложение Б) и в инновационную деятельность ООО ИТК Эндопринт (Акт о внедрении в инновационную деятельность утверждён операционным директором А.А. Казанбаевой) (Приложение В). Разработанные в рамках исследования материалы в виде медицинского изделия «Биорезорбируемый композиционный материал на основе поликапролактона и гидроксиапатита» внесены в Перечень перспективных для коммерциализации результатов исследований и разработок (Витрина перспективных разработок) на платформе ЕГИСУ НИОКТР. Созданы 5 объектов интеллектуальной собственности - патенты: «Деградируемый биоактивный имплантат для замещения циркулярных дефектов трубчатых костей» (патент № 2775108 РФ от 28.06.22), «Цилиндрический биоактивный имплантат для замещения циркулярных дефектов трубчатых костей» (патент № 780930 РФ от 04.10.22), «Полимерный композиционный материал для 3D печати изделий медицинского назначения» (патент № 2813693 РФ от 15.02.24), «Способ получения полимерного композиционного материала для изготовления изделий медицинского назначения» (патент № 2815644 РФ от 19.03.24), «Серкляжное полотно для охватывающей фиксации костных отломков и осколков при переломах и дефектах длинных костей» (патент № 2820632 РФ от 06.06.24).
Объект исследования: композиционные материалы на основе поли (е- капролактона), наполненного гидроксиапатитом, а также изготовленные из них методом 3D печати пористые скаффолды.
Предмет исследования: физико-химические, структурно-фазовые, механические и медико-биологические свойства полимерных композиционных материалов, а также изготовленных из них методом 3D печати биомиметических скаффолдов.
Методология и методы исследования. В основе методологии проведённого исследования лежал системный научный подход, направленный на выявление взаимосвязей между составом, структурой и технологией получения композиционных материалов на основе биоразлагаемых полиэфиров, а также их свойствами, определяющими эффективность применения в тканевой инженерии костной ткани. Основной гипотезой является предположение о том, что увеличение содержания гидроксиапатита в композиционном материале на основе поли (е- капролактона) свыше 10-20 масс.% приведёт к повышению биоактивных свойств при сохранении высокой эластичности, термической и химической стабильности материала благодаря свойствам выбранной полимерной матрицы.
Композиционные материалы получали смешиванием раствора поли (е- капролактона) в ацетоне с порошком гидроксиапатита с использованием шаровой мельницы, разработанной в Лаборатории плазменных гибридных систем НИ ТПУ. Композиционные филаменты для 3D печати биомиметических скаффолдов изготавливали на одношнековом экструдере Filabot EX2 (Filabot HQ, США). Композиционные биомиметические скаффолды получали методом Fused deposition modeling (FDM) 3D печати c использованием 3D принтера Ultimaker S5 (Ultimaker, Нидерланды). Для комплексного анализа материалов были применены современные физико-химические и механические методы. Химический состав и распределение элементов определяли с помощью ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье (ИКФС) и энергодисперсионного рентгеновского анализа (ЭДС). Фазовый состав исследовали методом рентгеновской дифрактометрии (РФА). Для оценки тепловых свойств и степени кристалличности полимеров использовали дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК) и термогравиметрический анализ (ТГА). Молекулярно-массовые характеристики определяли методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ). Морфология поверхности и распределение наполнителя вблизи поверхности анализировались с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Механические свойства образцов оценивали при сжатии. Исследования биосовместимости in vitro были проведены методом оценки жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток на поверхности скаффолдов. Для исследования биоактивности in vitro использовался метод оценки остеогенной дифференцировки остеобластов на поверхности скаффолдов. Биосовместимость и биоактивность in vivo изучали с использованием лабораторных животных в экспериментах с замещением крупного радиального дефекта большеберцовой кости барана и замещения дефекта носовой кости кролика. Статистическую обработку полученных экспериментальных результатов осуществляли с помощью программных комплексов Prism software (GraphPad, США) и OriginPro (OriginLab Corporation, США).
Положения, выносимые на защиту:
1. Способ получения композиционных материалов для 3D печати биомиметических скаффолдов на основе ПКЛ с наполнением до 40 масс.% ГА, заключающийся в смешивании в шаровой мельнице при скорости вращения 72 об/мин в течение 12 часов раствора ПКЛ в ацетоне и порошка ГА с последующим удалением ацетона при нагреве до 150 °C в течение 20 минут. Способ обеспечивает получение композиционных материалов с гомогенным распределением ГА в полимерной матрице с эффективностью наполнения до 94%.
2. Разработаны оптимальные режимы FDM 3D печати скаффолдов с биомиметической структурой в форме гироида из композиционных материалов на основе ПКЛ с наполнением ГА до 40 масс.%. Установлено, что скаффолды с наполнением ГА 40 масс.% сохраняют эластичность, сопоставимую с эластичностью скаффолдов из ПКЛ, характеризуемую пределом текучести, равным 3,4 МПа, и стимулируют увеличение количества активных остеобластов при имплантации в область костного дефекта.
3. Обработка биомиметических скаффолдов из ПКЛ и из композиционных материалов на основе ПКЛ и ГА смесью «растворитель/не растворитель» на основе толуола и этилового спирта в объёмном соотношении 3:7 с добавлением 10 масс.% порошка гидроксиапатита позволяет закрепить на их поверхности частицы гидроксиапатита, стимулирующие усиление остеогенной дифференцировки в 1,52 раза в сравнении с позитивным контролем с добавлением остеофакторов и обеспечивающие остеоинтеграцию скаффолда при имплантации в область радиального дефекта большеберцовой кости со значением рентгенологической плотности костного регенерата к 30-му дню после имплантации, составляющим 76% от плотности минерализованных костных структур.
Степень достоверности результатов обеспечивается применением современных аналитических методов и оборудования, а также их сопоставлением с данными, представленными в литературе по композиционным полимерным материалам для костной регенерации. Обоснованность выводов подтверждается корректной обработкой экспериментальных данных с использованием статистических методов.
Апробация результатов исследования. Результаты диссертационного исследования были представлены в форме докладов на 11 всероссийских и международных конференциях, конгрессах и саммитах: «International Congress on Energy Fluxes and Radiation Effects» (Томск, 2018 г.); Всероссийский научный семинар «Междисциплинарные проблемы аддитивных технологий» (Томск, 2018); Международная конференция «Перспективные материалы конструкционного и медицинского назначения» (Томск, 2018); Международная конференция «Наноматериалы и биоматериалы» (Барселона, 2018); Международная конференция «Перспективные материалы конструкционного и медицинского назначения» (Томск, 2019); Международная конференция «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2019 и 2022 г.); Саммит молодых учёных и инженеров «Большие вызовы для общества, государства и науки» (Сочи, 2019); Международная конференция «Ломоносов 2020» (Москва, 2020), Международная конференция «StemCellBio 2023» (Санкт-Петербург, 2023); Международная конференция «Разработка лекарственных средств - традиции и перспективы» (Томск, 2023).
Связь работы с научными программами и темами. Результаты научноквалификационной работы получены, в том числе при выполнении проектов:
- ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса на 2014-2020 годы», соглашение № 14.575.21.0140, «Разработка остеостимулирующих имплантатов на основе гибридных технологий модифицирования их поверхности и компьютерного моделирования выхода лекарственных препаратов для персонализированной медицины при политравме и онкологии» (2017-2020, руководитель - С.И. Твердохлебов, в числе исполнителей - Г.Е. Дубиненко);
- Приоритет-2030-НИП/ИЗ-127-375-2023 «3D полимерные имплантаты и материалы для остеозамещения», научно-исследовательская политика и политика в области инноваций и коммерциализации разработок, стратегический проект «Инженерия здоровья» (2023, руководитель работ по биорезорбируемым имплантатам - С.И. Твердохлебов, в числе исполнителей - Г.Е. Дубиненко);
- Госзадание «Разработка фундаментальных основ создания материалов, изделий, средств доставки, устройств контроля и визуализации для персонифицированной медицины и онкологии» шифр научной темы «FSWW-2023- 0007» (2023-2025, руководитель - С.И. Твердохлебов, в числе исполнителей - Г.Е. Дубиненко).
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах выполнения диссертационного исследования - от постановки задач до анализа и интерпретации результатов. Автором самостоятельно разработана экспериментальная схема, выполнены ключевые этапы получения и исследования композиционных материалов, а также проведена обработка и анализ физикохимических и биологических характеристик полученных образцов, включая обработку и анализ полученных данных, а также обработка и анализ результатов экспериментов in vitro и in vivo. Результаты исследований оформлены автором в виде тезисов, статей, опубликованных в российских и зарубежных изданиях, представлены на всероссийских и международных конференциях и конкурсах, оформлены в виде текстов патентов. Совместно с научным руководителем С.И. Твердохлебовым обсуждались промежуточные и финальные результаты, касающиеся свойств композитов и скаффолдов. Отдельные аспекты работы выполнялись при участии соавторов, имена которых приведены в перечне публикаций по теме диссертации.
Публикации. По теме диссертации Г.Е. Дубиненко опубликовано 16 работ, в том числе 7 статей в журналах, индексируемых в базе данных Scopus, 8 публикаций в сборниках материалов международных научных, научнопрактических, научно-технических конференций, 1 монография. В опубликованных работах достаточно полно изложены материалы диссертации.
Структура и объём диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения, списка условных обозначений и сокращений, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 126 страницах, содержат 34 рисунка, 4 таблицы и 8 приложений.
Степень разработанности темы исследования. Разработка и исследование композиционных материалов на основе биоразлагаемых полиэфиров для инженерии костных тканей выполняются в ряде ведущих исследовательских групп в России и за рубежом. Известны работы научных групп Университета науки и технологий МИСИС (Ф.С. Сенатов, Россия), НИЦ Курчатовского центра (С.Н. Чвалун, Россия), университета Саленте (C. Esposito Corcione, Италия), Квинслендского университета (D. Hutmacher, Австралия), университета Гренобль- Альпы (C. Picart, Франция). В Лаборатории плазменных гибридных систем НОЦ им. Б.П. Вейнберга Национального исследовательского Томского политехнического университета под руководством С.И. Твердохлебов более 10 лет ведутся разработки по созданию и функционализации полимерных, металлических и керамических материалов для создания имплантируемых изделий медицинского назначения.
Исследования показывают, что фосфаты кальция обладают высокой эффективностью в качестве наполнителей полимерных имплантатов для регенерации костных тканей. Добавление фосфатов кальция в полимерную матрицу обеспечивает биосовместимость имплантатов и способствует их лучшей остеоинтеграции. Эти характеристики делают композиционные материалы на основе алифатических полиэфиров и фосфатов кальция перспективными для использования в ортопедии и травматологии. Однако влияние высоких степеней наполнения биоактивными компонентами на физико-химические, биологические и технологические свойства таких материалов остаётся недостаточно изученным. Композиционные материалы с высоким содержанием наполнителя, превышающим 20 масс.%, способны более точно имитировать химический и фазовый состав костной ткани. Это, в свою очередь, может способствовать ускорению остеоинтеграции имплантатов и сокращению сроков остеосинтеза. Изучение и оптимизация таких высоконаполненных композиций является актуальной задачей.
Исходя из проведённого анализа, была сформулирована цель работы - разработка высоконаполненных биоактивных композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита для использования в качестве материала 3D печати биомиметических скаффолдов для регенерации костных тканей.
Для достижения поставленной цели сформулированы и решены следующие задачи:
1. Разработать способ получения композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита с наполнением до 40 масс.%.
2. Разработать режимы изготовления композиционных филаментов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита с наполнением до 40 масс.%.
3. Определить оптимальные условия FDM 3D печати биомиметических скаффолдов из композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита с наполнением до 40 масс.%.
4. Исследовать влияние способа получения и массовой доли гидроксиапатита на физико-химические и структурно-фазовые свойства композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита с наполнением до 40 масс.%.
5. Исследовать влияние массовой доли гидроксиапатита на физикохимические и биологические свойства биомиметических скаффолдов, изготовленных методом FDM 3D печати из композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита с наполнением до 40 масс.%.
6. Разработать способ функционализации поверхности биомиметических скаффолдов, изготовленных из композиционных материалов на основе поли (е- капролактона) и гидроксиапатита, для стимулирования остеогенной дифференцировки остеобластов на их поверхности.
Научная новизна:
1. Впервые предложен способ изготовления высоконаполненных композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита путём смешивания в низкоскоростной шаровой мельнице раствора поли (е- капролактона) в ацетоне с порошком гидроксиапатита. Предложенный способ позволяет получить композиционные материалы с наполнением гидроксиапатитом до 40 масс.%, эффективностью наполнения от 84 до 94% и гомогенным распределением наполнителя в полимерной матрице. Полученные композиционные материалы обладают высокой термической и химической стабильностью.
2. Для полученных композиционных материалов с наполнением гидроксиапатитом до 40 масс.% определены оптимальные режимы FDM 3D печати скаффолдов с биомиметической структурой в форме гироида. Установлены зависимости между массовой долей гидроксиапатита в материале и технологическими, физико-химическими и биологическими свойствами скаффолдов.
3. Впервые предложен способ закрепления частиц гидроксиапатита на поверхности скаффолдов путём обработки в смеси «растворитель/не растворитель». Установлено, что обработка биомиметических скаффолдов из композиционных материалов суспензией гидроксиапатита в смеси толуола и этанола позволяет закрепить на их поверхности частицы гидроксиапатита. Частицы гидроксиапатита индуцируют остеогенную дифференцировку остеобластов на поверхности скаффолдов и обеспечивают остеоинтеграцию скаффолдов при имплантации в область радиального дефекта трубчатой кости.
Теоретическая значимость заключается в получении новых научных результатов, имеющих фундаментальное значение в областях медицинского материаловедения и разработки медицинских изделий для регенерации костных тканей. В работе установлены ключевые положения, касающиеся получения биорезорбируемых композиционных материалов на основе поли (е-капролактона) и гидроксиапатита, обладающих биоактивными свойствами. Выявлены закономерности влияния состава композиционных материалов на технологические параметры 3D печати биомиметических скаффолдов по технологии FDM, их физико-химические и механические свойства, а также биосовместимость. Установлены новые взаимосвязи между массовой долей наполнителя, химическим составом, термическими и механическими свойствами, структурно-фазовым строением полученных композиционных материалов и изготовленных из них методом FDM 3D печати биомиметических скаффолдов. Установленные закономерности способствуют развитию фундаментальных и прикладных знаний о биорезорбируемых композиционных материалах для регенерации костных тканей.
Практическая значимость состоит в том, что выявленные закономерности влияния состава и способа получения композиционных материалов на их физикохимические, биологические и технологические свойства могут быть использованы для создания новых биорезорбируемых медицинских изделий, предназначенных для регенерации костных тканей. Результаты исследования были внедрены в научную деятельность и экспериментальную клиническую практику в ФГБУ «НМИЦ ТО имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава России (Акты об использовании результатов диссертационной работы в исследованиях и экспериментальной клинической практике утверждены заместителем директора по научной работе, к.б.н., Е.Н. Овчинниковым) (Приложение А), в научную деятельность ФГБОУ ВО СЗГМУ имени И.И. Мечникова Минздрава России (Акт внедрения в научную деятельность утверждён д.м.н., профессором, проректором по науке и инновационной деятельности Н.В. Бакулиной) (Приложение Б) и в инновационную деятельность ООО ИТК Эндопринт (Акт о внедрении в инновационную деятельность утверждён операционным директором А.А. Казанбаевой) (Приложение В). Разработанные в рамках исследования материалы в виде медицинского изделия «Биорезорбируемый композиционный материал на основе поликапролактона и гидроксиапатита» внесены в Перечень перспективных для коммерциализации результатов исследований и разработок (Витрина перспективных разработок) на платформе ЕГИСУ НИОКТР. Созданы 5 объектов интеллектуальной собственности - патенты: «Деградируемый биоактивный имплантат для замещения циркулярных дефектов трубчатых костей» (патент № 2775108 РФ от 28.06.22), «Цилиндрический биоактивный имплантат для замещения циркулярных дефектов трубчатых костей» (патент № 780930 РФ от 04.10.22), «Полимерный композиционный материал для 3D печати изделий медицинского назначения» (патент № 2813693 РФ от 15.02.24), «Способ получения полимерного композиционного материала для изготовления изделий медицинского назначения» (патент № 2815644 РФ от 19.03.24), «Серкляжное полотно для охватывающей фиксации костных отломков и осколков при переломах и дефектах длинных костей» (патент № 2820632 РФ от 06.06.24).
Объект исследования: композиционные материалы на основе поли (е- капролактона), наполненного гидроксиапатитом, а также изготовленные из них методом 3D печати пористые скаффолды.
Предмет исследования: физико-химические, структурно-фазовые, механические и медико-биологические свойства полимерных композиционных материалов, а также изготовленных из них методом 3D печати биомиметических скаффолдов.
Методология и методы исследования. В основе методологии проведённого исследования лежал системный научный подход, направленный на выявление взаимосвязей между составом, структурой и технологией получения композиционных материалов на основе биоразлагаемых полиэфиров, а также их свойствами, определяющими эффективность применения в тканевой инженерии костной ткани. Основной гипотезой является предположение о том, что увеличение содержания гидроксиапатита в композиционном материале на основе поли (е- капролактона) свыше 10-20 масс.% приведёт к повышению биоактивных свойств при сохранении высокой эластичности, термической и химической стабильности материала благодаря свойствам выбранной полимерной матрицы.
Композиционные материалы получали смешиванием раствора поли (е- капролактона) в ацетоне с порошком гидроксиапатита с использованием шаровой мельницы, разработанной в Лаборатории плазменных гибридных систем НИ ТПУ. Композиционные филаменты для 3D печати биомиметических скаффолдов изготавливали на одношнековом экструдере Filabot EX2 (Filabot HQ, США). Композиционные биомиметические скаффолды получали методом Fused deposition modeling (FDM) 3D печати c использованием 3D принтера Ultimaker S5 (Ultimaker, Нидерланды). Для комплексного анализа материалов были применены современные физико-химические и механические методы. Химический состав и распределение элементов определяли с помощью ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье (ИКФС) и энергодисперсионного рентгеновского анализа (ЭДС). Фазовый состав исследовали методом рентгеновской дифрактометрии (РФА). Для оценки тепловых свойств и степени кристалличности полимеров использовали дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК) и термогравиметрический анализ (ТГА). Молекулярно-массовые характеристики определяли методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ). Морфология поверхности и распределение наполнителя вблизи поверхности анализировались с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Механические свойства образцов оценивали при сжатии. Исследования биосовместимости in vitro были проведены методом оценки жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток на поверхности скаффолдов. Для исследования биоактивности in vitro использовался метод оценки остеогенной дифференцировки остеобластов на поверхности скаффолдов. Биосовместимость и биоактивность in vivo изучали с использованием лабораторных животных в экспериментах с замещением крупного радиального дефекта большеберцовой кости барана и замещения дефекта носовой кости кролика. Статистическую обработку полученных экспериментальных результатов осуществляли с помощью программных комплексов Prism software (GraphPad, США) и OriginPro (OriginLab Corporation, США).
Положения, выносимые на защиту:
1. Способ получения композиционных материалов для 3D печати биомиметических скаффолдов на основе ПКЛ с наполнением до 40 масс.% ГА, заключающийся в смешивании в шаровой мельнице при скорости вращения 72 об/мин в течение 12 часов раствора ПКЛ в ацетоне и порошка ГА с последующим удалением ацетона при нагреве до 150 °C в течение 20 минут. Способ обеспечивает получение композиционных материалов с гомогенным распределением ГА в полимерной матрице с эффективностью наполнения до 94%.
2. Разработаны оптимальные режимы FDM 3D печати скаффолдов с биомиметической структурой в форме гироида из композиционных материалов на основе ПКЛ с наполнением ГА до 40 масс.%. Установлено, что скаффолды с наполнением ГА 40 масс.% сохраняют эластичность, сопоставимую с эластичностью скаффолдов из ПКЛ, характеризуемую пределом текучести, равным 3,4 МПа, и стимулируют увеличение количества активных остеобластов при имплантации в область костного дефекта.
3. Обработка биомиметических скаффолдов из ПКЛ и из композиционных материалов на основе ПКЛ и ГА смесью «растворитель/не растворитель» на основе толуола и этилового спирта в объёмном соотношении 3:7 с добавлением 10 масс.% порошка гидроксиапатита позволяет закрепить на их поверхности частицы гидроксиапатита, стимулирующие усиление остеогенной дифференцировки в 1,52 раза в сравнении с позитивным контролем с добавлением остеофакторов и обеспечивающие остеоинтеграцию скаффолда при имплантации в область радиального дефекта большеберцовой кости со значением рентгенологической плотности костного регенерата к 30-му дню после имплантации, составляющим 76% от плотности минерализованных костных структур.
Степень достоверности результатов обеспечивается применением современных аналитических методов и оборудования, а также их сопоставлением с данными, представленными в литературе по композиционным полимерным материалам для костной регенерации. Обоснованность выводов подтверждается корректной обработкой экспериментальных данных с использованием статистических методов.
Апробация результатов исследования. Результаты диссертационного исследования были представлены в форме докладов на 11 всероссийских и международных конференциях, конгрессах и саммитах: «International Congress on Energy Fluxes and Radiation Effects» (Томск, 2018 г.); Всероссийский научный семинар «Междисциплинарные проблемы аддитивных технологий» (Томск, 2018); Международная конференция «Перспективные материалы конструкционного и медицинского назначения» (Томск, 2018); Международная конференция «Наноматериалы и биоматериалы» (Барселона, 2018); Международная конференция «Перспективные материалы конструкционного и медицинского назначения» (Томск, 2019); Международная конференция «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2019 и 2022 г.); Саммит молодых учёных и инженеров «Большие вызовы для общества, государства и науки» (Сочи, 2019); Международная конференция «Ломоносов 2020» (Москва, 2020), Международная конференция «StemCellBio 2023» (Санкт-Петербург, 2023); Международная конференция «Разработка лекарственных средств - традиции и перспективы» (Томск, 2023).
Связь работы с научными программами и темами. Результаты научноквалификационной работы получены, в том числе при выполнении проектов:
- ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса на 2014-2020 годы», соглашение № 14.575.21.0140, «Разработка остеостимулирующих имплантатов на основе гибридных технологий модифицирования их поверхности и компьютерного моделирования выхода лекарственных препаратов для персонализированной медицины при политравме и онкологии» (2017-2020, руководитель - С.И. Твердохлебов, в числе исполнителей - Г.Е. Дубиненко);
- Приоритет-2030-НИП/ИЗ-127-375-2023 «3D полимерные имплантаты и материалы для остеозамещения», научно-исследовательская политика и политика в области инноваций и коммерциализации разработок, стратегический проект «Инженерия здоровья» (2023, руководитель работ по биорезорбируемым имплантатам - С.И. Твердохлебов, в числе исполнителей - Г.Е. Дубиненко);
- Госзадание «Разработка фундаментальных основ создания материалов, изделий, средств доставки, устройств контроля и визуализации для персонифицированной медицины и онкологии» шифр научной темы «FSWW-2023- 0007» (2023-2025, руководитель - С.И. Твердохлебов, в числе исполнителей - Г.Е. Дубиненко).
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах выполнения диссертационного исследования - от постановки задач до анализа и интерпретации результатов. Автором самостоятельно разработана экспериментальная схема, выполнены ключевые этапы получения и исследования композиционных материалов, а также проведена обработка и анализ физикохимических и биологических характеристик полученных образцов, включая обработку и анализ полученных данных, а также обработка и анализ результатов экспериментов in vitro и in vivo. Результаты исследований оформлены автором в виде тезисов, статей, опубликованных в российских и зарубежных изданиях, представлены на всероссийских и международных конференциях и конкурсах, оформлены в виде текстов патентов. Совместно с научным руководителем С.И. Твердохлебовым обсуждались промежуточные и финальные результаты, касающиеся свойств композитов и скаффолдов. Отдельные аспекты работы выполнялись при участии соавторов, имена которых приведены в перечне публикаций по теме диссертации.
Публикации. По теме диссертации Г.Е. Дубиненко опубликовано 16 работ, в том числе 7 статей в журналах, индексируемых в базе данных Scopus, 8 публикаций в сборниках материалов международных научных, научнопрактических, научно-технических конференций, 1 монография. В опубликованных работах достаточно полно изложены материалы диссертации.
Структура и объём диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения, списка условных обозначений и сокращений, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 126 страницах, содержат 34 рисунка, 4 таблицы и 8 приложений.
В рамках диссертационного исследования был разработан способ получения высоконаполненных композиционных материалов на основе ПКЛ и ГА с содержанием наполнителя ГА до 40 масс.%. Разработанный способ обеспечивает равномерное распределение частиц ГА в полимерной матрице при сохранении высокой химической и термической стабильности материала. Композиционные материалы были успешно использованы для 3D печати биомиметических пористых скаффолдов, обладающих высокой биосовместимостью. Для повышения биоактивных свойств скаффолдов был разработан способ модифицирования с целью закрепления на их поверхности дисперсных частиц ГА. Модифицированные скаффолды обладают высокой биосовместимостью, способностью стимулировать остеогенную дифференцировку остеобластов и обеспечивают эффективную остеоинтеграцию.
Научным результатом работы является получение новых научных знаний, имеющих фундаментальное значение в областях медицинского материаловедения и разработки медицинских изделий для регенерации костных тканей. В работе установлены ключевые положения, касающиеся получения биорезорбируемых композиционных материалов на основе ПКЛ и ГА, обладающих биоактивными свойствами. Также в рамках работы была подтверждена основная научная гипотеза, положенная в основу исследования.
Научным результатом работы является получение новых научных знаний, имеющих фундаментальное значение в областях медицинского материаловедения и разработки медицинских изделий для регенерации костных тканей. В работе установлены ключевые положения, касающиеся получения биорезорбируемых композиционных материалов на основе ПКЛ и ГА, обладающих биоактивными свойствами. Также в рамках работы была подтверждена основная научная гипотеза, положенная в основу исследования.
